植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可以平衡腸道微生物菌群，提高免疫功能，但由于植物乳桿菌在食品制造、運(yùn)輸、儲(chǔ)存及人體胃腸道消化過(guò)程中會(huì)遇到環(huán)境壓力，如高溫、鹽、氧氣及胃液和膽鹽等因素的影響，從而降低生物利用度，限制其功能特性的發(fā)揮。水凝膠是由一種或多種天然或合成聚合物組成，能夠保護(hù)益生菌免受其在食品加工過(guò)程中惡劣條件的影響，同時(shí)凝膠基質(zhì)可以抵抗載體在胃腸道發(fā)生化學(xué)和酶降解，并有效地在結(jié)腸中釋放其負(fù)載的生物成分，是目前研究中發(fā)現(xiàn)的一項(xiàng)較好的益生菌保護(hù)機(jī)制。明膠（GE）是由膠原蛋白部分水解而來(lái)，是一種常用的蛋白質(zhì)類水凝膠。

因此，河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)六偏磷酸鈉（SHMP）對(duì)GE進(jìn)行修飾構(gòu)建初級(jí)網(wǎng)絡(luò)水凝膠，加入植物乳桿菌后利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TGase）進(jìn)一步修飾GE/SHMP，使其更有利于植物乳桿菌遞送，以GE、GE/SHMP水凝膠及包埋體作為對(duì)照，利用物理和化學(xué)分析方法對(duì)水凝膠復(fù)合體系的結(jié)構(gòu)及性能進(jìn)行分析，探討GE/SHMP/TGase的作用機(jī)理及包埋植物乳桿菌后對(duì)水凝膠性能的影響，以期為益生菌功能性食品的開發(fā)及貯藏提供理論依據(jù)。

1 處理方式對(duì)復(fù)合水凝膠包埋體凝膠強(qiáng)度影響

通常情況下，凝膠強(qiáng)度受氨基酸含量、分子質(zhì)量分布和提取過(guò)程的影響。SHMP和TGase修飾的GE復(fù)合體的強(qiáng)度高于單一經(jīng)SHMP修飾的GE，說(shuō)明經(jīng)TGase修飾后能顯著增加GE的凝膠強(qiáng)度。雖然向體系中加入植物乳桿菌后可能會(huì)干擾凝膠基質(zhì)中GE/SHMP或TGase分子的相互作用，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)不均勻，水凝膠的凝膠強(qiáng)度降低，但結(jié)果表明GE/SHMP/TGase復(fù)合水凝膠的膠強(qiáng)度顯著高于GE/SHMP復(fù)合水凝膠及單一的GE水凝膠（P＜0.05），說(shuō)明GE/SHMP/TGase復(fù)合水凝膠包埋體的分子間作用力較強(qiáng)，有利于包埋的植物乳桿菌的抵抗不良環(huán)境的影響。

2 復(fù)合水凝膠包埋體膠凝動(dòng)力學(xué)分析

在最初0.5 h內(nèi)所有凝膠體系的G’和損耗模量G”都以較快的速率增長(zhǎng)，G’和G”在某一點(diǎn)（即凝膠點(diǎn)）相交后G’變得高于G”，這表明在冷卻過(guò)程中形成了凝膠膠體。由于凝膠化過(guò)程是GE分子從無(wú)規(guī)卷曲變成三螺旋的過(guò)程，膠體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成后，G’隨著時(shí)間的推移以較小的速率增加，表明GE及復(fù)合物繼續(xù)形成三螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步增強(qiáng)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。對(duì)凝膠動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)所有復(fù)合凝膠體系的G’和G”隨著時(shí)間的延長(zhǎng)凝膠G’在95%的置信區(qū)間內(nèi)具有典型的一致變化。對(duì)圖2B、D、F分析可知當(dāng)加入植物乳桿菌后會(huì)減少分子之間的物理相互作用或共價(jià)交聯(lián)鍵的數(shù)量，凝膠G’損失，從而影響凝膠網(wǎng)絡(luò)連接，導(dǎo)致加菌后凝膠形成的速率比未加菌凝膠形成速率低。對(duì)比圖2A、C、E可知，經(jīng)改性后復(fù)合凝膠形成速率顯著低于單一GE的膠凝速率，這是因?yàn)門Gase催化GE產(chǎn)生空間效應(yīng)從而形成了含有共價(jià)鍵的聚合物，該絡(luò)合物限制了GE分子鏈的靈活性，從而降低了其凝膠化速率。

3 復(fù)合水凝膠包埋體水分分布狀態(tài)分析

經(jīng)復(fù)合水凝膠對(duì)應(yīng)的水的特征是在0.01～1 ms（T21）范圍內(nèi)具有最小的流動(dòng)性；在1～100 ms（T22）范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個(gè)很小的弱峰，表示水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的水流動(dòng)性較差；在100～10000 ms（T23）范圍內(nèi)相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)低于游離水，說(shuō)明游離水位于交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)之外，具有優(yōu)異的流動(dòng)性。而較短的初始弛豫時(shí)間T2對(duì)應(yīng)于水與基質(zhì)之間結(jié)合更加緊密，水的流動(dòng)分?jǐn)?shù)更小，水凝膠樣品的自由度和遷移率較低，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密，另外從圖3可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SHMP和TGase修飾后水凝膠樣品各峰面積所占比例高于GE，這可能是因?yàn)榱姿峄^(guò)程中引入了負(fù)電荷，在GE分子鏈中引入磷酸基團(tuán)可以增強(qiáng)磷酸基團(tuán)與GE中氨基酸的NH3+之間的離子相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集，進(jìn)一步限制了水分子的流動(dòng)。表明GE/SHMP/TGase復(fù)合水凝膠包埋體相對(duì)于單一的GE基水凝膠，體系對(duì)水的結(jié)合能力得到了極大的改善，能將水分子牢固地保留在凝膠網(wǎng)絡(luò)中，進(jìn)而可以提升凝膠的pH值響應(yīng)能力，調(diào)節(jié)植物乳桿菌在模擬胃液中的釋放行為。

4 復(fù)合水凝膠包埋體的穩(wěn)定性分析

對(duì)于GE，Td通常指的是螺旋-螺旋轉(zhuǎn)變溫度，Td值主要與GE分子鏈之間的非共價(jià)相互作用和三螺旋樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量有關(guān)，它代表三螺旋結(jié)構(gòu)中氫鍵的斷裂和無(wú)規(guī)則螺旋的形成，反映了GE體系中三螺旋狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。GE/SHMP/TGase復(fù)合水凝膠的熱變性溫度高于GE/SHMP高于GE，說(shuō)明GE經(jīng)SHMP及TGase修飾后熱變性溫度提高，這是因?yàn)镚E三螺旋和最終網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要能量來(lái)源于GE鏈之間形成的氫鍵或疏水相互作用，而這種相互作用是非共價(jià)結(jié)合，形成的穩(wěn)定性差、對(duì)熱敏感，而GE/SHMP是通過(guò)離子之間的靜電相互作用而交聯(lián)在一起，因此需要更多的熱量才能破壞其穩(wěn)定性，酶交聯(lián)后蛋白側(cè)鏈上特定基團(tuán)交聯(lián)形成了更大的分子，產(chǎn)生了大量的高能異肽共價(jià)鍵，從而使產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，表明TGase的存在提高了該復(fù)合包埋體系的化學(xué)穩(wěn)定性。

5 復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)特征分析

5.1 復(fù)合凝膠形成過(guò)程中三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

磷酸化GE的熒光強(qiáng)度高于單一GE，可能是由于磷酸化使GE的芳香基團(tuán)暴露從而使其三級(jí)構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)展開，可以推測(cè)磷酸化促使GE的芳香族氨基酸暴露在水中并與蛋白質(zhì)分子表面的磷酸化基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。在磷酸化預(yù)處理后TGase介導(dǎo)交聯(lián)，觀察到發(fā)射波長(zhǎng)最大值藍(lán)移（527.01～525.97 nm），表明蛋白質(zhì)中的氨基酸經(jīng)過(guò)磷酸化預(yù)處理后TGase介導(dǎo)交聯(lián)改變了GE的氨基酸微環(huán)境的極性。當(dāng)植物乳桿菌被添加到凝膠中時(shí)，GE分子之間的氫鍵和靜電相互作用減少，從而將疏水基團(tuán)驅(qū)逐到表面，對(duì)于單一含有植物乳桿菌的GE，植物乳桿菌的存在導(dǎo)致凝膠的熒光強(qiáng)度降低，并伴有輕微的紅移，這表明這些蛋白質(zhì)將其含色氨酸的延伸區(qū)暴露于極性更大的環(huán)境（水相），植物乳桿菌產(chǎn)生強(qiáng)烈的空間位阻效應(yīng)，從而阻斷色氨酸殘基的熒光信號(hào)，并因此導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。

5.2 復(fù)合凝膠形成過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

磷酸化GE的FTIR光譜圖如圖6所示。通常酰胺A與分子內(nèi)氫鍵偶合的—NH伸縮振動(dòng)有關(guān)，對(duì)于GE酰胺A的吸收峰出現(xiàn)在3420 cm-1附近，GE/SHMP與GE/SHMP/TGase酰胺A的吸收峰分別出現(xiàn)在3408 cm-1和3356 cm-1處，GE/SHMP/TGase有明顯的紅移，這可能是由于GE中的—COOH、—OH基團(tuán)和—NH殘基之間形成了更多的氫鍵。在2360 cm-1處發(fā)生了明顯的變化這是二氧化碳呼吸峰造成。磷酸化GE酰胺I帶的變化歸因于C＝O伸縮振動(dòng)，該伸縮振動(dòng)與CCN變形、CN伸縮和NH平面內(nèi)彎曲模的貢獻(xiàn)相偶合，分別在1666 cm-1（GE/SHMP）和1668 cm-1（GE/SHMP/TGase）附近，而GE的酰胺I帶約為1646 cm-1，與未磷酸化GE的結(jié)果相比磷酸化后發(fā)生明顯藍(lán)移，這可能是由于引入磷酸基團(tuán)產(chǎn)生的靜電相互作用。從圖6可以看出，GE在1244 cm-1處僅有一個(gè)很弱的吸收峰，這表明GE鏈中引入了磷酸基團(tuán)，可以推斷磷酸化GE中可能形成C—N—P鍵。在707～1082 cm-1范圍內(nèi)的吸收帶對(duì)應(yīng)于C—C和C—O—C骨架的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，GE在該范圍內(nèi)具有很多較小的弱峰，而GE/SHMP與GE/SHMP/TGase在該處的峰增強(qiáng)，峰位變尖，說(shuō)明在該處碳鏈骨架增長(zhǎng)，進(jìn)一步證實(shí)了GE/SHMP/TGase水凝膠通過(guò)非共價(jià)鍵及共價(jià)鍵結(jié)合形成了致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于植物乳桿菌的包埋。

5.3 復(fù)合凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

所有凝膠樣品均呈蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與典型的GE網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)一致。添加TGase后水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)更加有序和穩(wěn)定，水凝膠中出現(xiàn)層狀結(jié)構(gòu)和多孔結(jié)構(gòu)的組合，但GE/SHMP/TGase水凝膠的孔徑遠(yuǎn)小于GE/SHMP的水凝膠，使其更適合益生菌的遞送系統(tǒng)。嵌入益生菌的水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)與不含益生菌的水凝膠相似，但前者略顯不規(guī)則。

5.4 圖解模型

建立關(guān)于SHMP與TGase增加GE功能特性的模式圖。蛋白質(zhì)的天冬氨酸基（β-羧基）、蘇氨酸基、絲氨基和酪氨酸殘基上的氧與磷酸基團(tuán)相連，形成了非共價(jià)鍵，引入的磷酸基團(tuán)可以與水分子形成大量的氫鍵，促進(jìn)了凝膠網(wǎng)絡(luò)的形，加入植物乳桿菌后，其通過(guò)氫鍵和疏水相互作用嵌入GE/SHMP復(fù)合水凝膠中。由于引入的磷酸基團(tuán)增加了蛋白質(zhì)體系的電負(fù)性，磷酸化預(yù)處理后導(dǎo)致GE的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，暴露出更多的TGase作用位點(diǎn)。TGase靶向交聯(lián)谷氨酰胺的γ-COOH和賴氨酸的ε-NH2，形成了共價(jià)鍵。TGase的進(jìn)一步交聯(lián)導(dǎo)致小分子質(zhì)量聚合物消失，通過(guò)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和蛋白質(zhì)分子之間的共價(jià)和非共價(jià)交聯(lián)，增加了大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)聚合物的形成和含量。

6 植物乳桿菌在模擬胃液腸液中的存活性及釋放性分析

所有類型水凝膠包埋的植物乳桿菌細(xì)胞活菌數(shù)在9.48～9.59（lg（CFU/mL））。經(jīng)模擬胃液消化后GE/SHMP/TGase、GE/SHMP、GE水凝膠中植物乳桿菌存活率相對(duì)于初始活菌數(shù)分別為89.5%、62.3%、57.02%。這些結(jié)果表明將植物乳桿菌包裹在GE/SHMP/TGase水凝膠中可以最大限度保護(hù)植物乳桿菌活菌數(shù)免受胃液中不利條件的影響。GE/SHMP/TGase水凝膠中植物乳桿菌活菌數(shù)的提高是因?yàn)槠渲旅艿木W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以抑制胃酶滲透到凝膠網(wǎng)絡(luò)中。此外，由于其具有較高的凝膠強(qiáng)度，分子間的相互作用力強(qiáng)，從而降低胃酸和胃蛋白酶向水凝膠中的擴(kuò)散速率。水凝膠經(jīng)模擬腸液處理2 h后，所有類型的水凝膠中植物乳桿菌活細(xì)胞數(shù)均減少，但其下降速率顯著低于在胃液中的活細(xì)胞數(shù)，說(shuō)明大多數(shù)植物乳桿菌死亡發(fā)生在模擬胃液處理期間，這可能是由于植物乳桿菌對(duì)胃酸的耐受性相對(duì)較低所致。單一GE凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較差對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)性低，導(dǎo)致其在模擬胃液消化后代謝活性降低，經(jīng)模擬腸液處理后下降了4 個(gè)對(duì)數(shù)周期，而復(fù)合水凝膠基質(zhì)中在模擬腸液中僅下降了1 個(gè)對(duì)數(shù)周期，這可能是復(fù)合水凝膠中的凝膠網(wǎng)絡(luò)可以通過(guò)減緩低酸性環(huán)境對(duì)植物乳桿菌的代謝活性造成影響，從而對(duì)其起到一定的保護(hù)作用。

不同復(fù)合材料的累計(jì)釋放速率不同，單一GE中植物乳桿菌的釋放速率在前30 min內(nèi)迅速增加，然后在其余時(shí)間緩慢增加，之后保持不變，GE/SHMP水凝膠在0～60 min內(nèi)觀察到較低的釋放率，在消化60 min后也顯示出突然釋放，表明凝膠結(jié)構(gòu)的形成能夠延緩其在模擬胃液階段的釋放。復(fù)合水凝膠的累計(jì)釋放量為66.2%略高于GE/SHMP（44.6%）和GE（37.0%），在模擬胃液中GE/SHMP/TGase釋放速率最慢，而在模擬腸液中的釋放速率變快。造成上述差異的原因由很多因素決定，包括活性成分的性質(zhì)、水凝膠的結(jié)構(gòu)和大小、聚合物的性質(zhì)以及聚合物基質(zhì)的相互作用。GE/SHMP/TGase不僅對(duì)植物乳桿菌的控釋具有協(xié)同作用，還有助于增加模擬腸液消化后的累積釋放。

7 復(fù)合凝膠包埋體貯藏穩(wěn)定性分析

水凝膠中的植物乳桿菌在4 ℃定期監(jiān)測(cè)28 d期間其穩(wěn)定性，在貯存期間具GE/SHMP/TGase水凝膠中植物乳桿菌的活菌數(shù)沒有明顯變化，但對(duì)于其他水凝膠，植物乳桿菌的存活率趨于降低。這可能是因?yàn)镚E/SHMP/TGase具有致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和厚壁的蜂窩狀微觀結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出最佳保水能力，有效減少了水凝膠脫水收縮導(dǎo)致的益生菌損失。

8 結(jié)論

本研究主要以GE/SHMP/TGase制備復(fù)合水凝膠包埋體，以GE、GE/SHMP水凝膠及包埋體作為對(duì)照，通過(guò)對(duì)水凝膠及包埋體的流變特性、凝膠強(qiáng)度、水分遷移狀況、熱穩(wěn)定性、微觀結(jié)構(gòu)、FTIR光譜及熒光光譜進(jìn)行測(cè)定，研究GE/SHMP/TGase的作用機(jī)理及對(duì)植物乳桿菌的包埋效果。通過(guò)對(duì)凝膠體系的流變性能、熱穩(wěn)定性及微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)GE/SHMP/TGase復(fù)合水凝膠的凝膠形成速率較低，酶交聯(lián)后蛋白側(cè)鏈特定基團(tuán)交聯(lián)形成了更大的分子，產(chǎn)生了大量的高能異肽共價(jià)鍵，導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性增加，形成了更加穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于植物乳桿菌的長(zhǎng)期穩(wěn)定的存在。低場(chǎng)核磁共振分析表明GE/SHMP/TGase具有更好的保水作用，SHMP和TGase的引入可以改變體系對(duì)水的結(jié)合能力，促進(jìn)凝膠形成更加致密的空間網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可以提升殼層凝膠的pH值響應(yīng)能力，調(diào)節(jié)包埋物質(zhì)在SCF中的釋放行為。

模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)模擬胃液和模擬腸液消化后，GE/SHMP/TGase水凝膠包埋的植物乳桿菌的存活率顯著高于單一GE基水凝膠。貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GE/SHMP/TGase水凝膠包埋的植物乳桿菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性（28 d內(nèi)）較好。進(jìn)一步證實(shí)該復(fù)合水凝膠包埋體具有較高的穩(wěn)定性、流變特性、保水性及凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特性等性能。因此，利用GE/SHMP/TGase復(fù)合水凝膠包埋植物乳桿菌，可以有效提升植物乳桿菌的在胃腸道等不利因素下的存活性，為益生菌產(chǎn)品的開發(fā)提供有益參考。

相關(guān)鏈接：六偏磷酸鈉，谷氨酰胺，色氨酸，明膠，植物乳桿菌，北納生物

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