1 Introduction

糖尿病是一種代謝綜合癥，2021年全世界的患病人數(shù)達(dá)5.37億人。大多數(shù)糖尿病患者屬于2型糖尿病（T2DM），主要是由不同程度的胰島素缺乏和胰島素抵抗所致。血液中胰高血糖素樣肽-1（glucagon -like peptide-1, GLP-1）由小腸分泌，它的活性形式在胰細(xì)胞葡萄糖依賴性胰島素的生物合成和分泌中發(fā)揮著重要作用，但是活性胰高血糖素樣肽-1會(huì)被二肽基肽酶-IV（DPP-IV）快速降解而失去活性，從而抑制胰島素的分泌，致使血糖升高。食物源的DPP-IV抑制肽具有良好的降血糖效果，可以作為治療高血糖化學(xué)合成藥物的潛在替代品。已報(bào)道的海洋蛋白質(zhì)如大口黑鱸、海藻、鮭魚、沙丁魚等是產(chǎn)生各種DPP-Ⅳ抑制肽的良好來源。然而，目前多數(shù)發(fā)現(xiàn)的DPP-Ⅳ抑制肽通常是通過使用市售蛋白酶水解蛋白質(zhì)制備的，由于其水解位點(diǎn)的限制，導(dǎo)致產(chǎn)生的DPP-Ⅳ抑制肽的多樣性較低，從而限制了具有高生物活性的新型DPP-Ⅳ抑制肽的發(fā)現(xiàn)。

發(fā)酵食品是生物活性肽的良好來源。發(fā)酵食品中復(fù)雜的微生物群落可產(chǎn)生多種多樣的蛋白酶，為發(fā)現(xiàn)新型高生物活性DPP-Ⅳ抑制肽提供了可能。然而，目前對(duì)發(fā)酵食品特別是水產(chǎn)發(fā)酵食品中DPP-Ⅳ抑制肽的研究較少。臭鱖魚是一種以鱖魚為原料制作的傳統(tǒng)水產(chǎn)發(fā)酵食品。臭鱖魚中的微生物菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且能夠分泌多種多樣的蛋白酶，因此會(huì)產(chǎn)生更多結(jié)構(gòu)多樣的活性肽。而且，鱖魚蛋白中富含脯氨酸，為高活性DPP-IV抑制肽的篩選提供了可能。

近日，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所采用宏基因組學(xué)、多肽組學(xué)及虛擬篩選技術(shù)，解析了臭鱖魚發(fā)酵過程微生物菌群與DPP-Ⅳ抑制肽的變化規(guī)律，借助模擬酶切與相關(guān)性網(wǎng)路圖，揭示了微生物代謝導(dǎo)致的臭鱖魚中DPP-Ⅳ抑制肽的形成機(jī)制。利用分子對(duì)接技術(shù)研究了臭鱖魚中DPP-Ⅳ抑制肽與DPP-Ⅳ的能量相互作用，進(jìn)而闡明了DPP-Ⅳ抑制肽的作用機(jī)制。

2 Results and discussion

2.1 臭鱖魚中DPP-IV抑制肽的虛擬篩選

DPP-IV抑制活性實(shí)驗(yàn)表明，臭鱖魚的多肽提取物具有較高的DPP-IV抑制活性，且發(fā)酵后活性明顯增加。利用多肽組學(xué)技術(shù)在臭鱖魚多肽提取物中共鑒定出8 252 種游離多肽，通過活性網(wǎng)站BIOPEP-UWM搜索具有DPP-IV抑制活性的氨基酸殘基片段，不同發(fā)酵時(shí)間臭鱖魚多肽中共有278 種具有DPP-IV抑制活性的氨基酸殘基，其中KA (2120)、VK (2043)、AE (2025)、KK (1990)、KE (1974)、EK (1957)、EV (1448)、KV (1433)、VE (1424)、PA (1285)、VD (1283)、AD (1270)、KP (1258)、TV (1251)、ET (1221)、AA (1213)、EP (1157)、AP (1111)、AL (1067)和KT (1021)是多肽中出現(xiàn)最多的氨基酸殘基序列。從這些多肽中篩選出疏水性最高（≥22.24 kcal/mol）的前400條肽（P1-P400）作為DPP-IV抑制肽，作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)DPP-IV抑制肽的豐度在發(fā)酵后顯著增加。

2.2 臭鱖魚發(fā)酵過程中微生物菌群變化

臭鱖魚中共鑒定出Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Fusobacteria、Actinobacteria、Uroviricota等6 個(gè)細(xì)菌門，其中Firmicutes和Proteobacteria為優(yōu)勢(shì)菌門，在整個(gè)發(fā)酵過程中總相對(duì)豐度均超過84%。在不同發(fā)酵時(shí)間下相對(duì)豐度≥0.1%的菌屬共69 個(gè)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，Escherichia、Bacillus、Kocuria和Pseudomonas的相對(duì)豐度顯著降低，而Vagococcus、Psychrobacter、Enterococcus和Peptostreptococcus的相對(duì)豐度有所提高。

2.3 臭鱖魚中關(guān)鍵微生物屬與DPP-IV抑制肽的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)

基于Pearson相關(guān)性數(shù)據(jù)構(gòu)建了35個(gè)豐度最高的微生物菌屬與50個(gè)豐度最高的DPP-IV抑制肽的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，共發(fā)現(xiàn)了三個(gè)微生物聚類，有21個(gè)菌屬與30多個(gè)DPP-IV抑制肽顯著相關(guān)。Lactococcus、Bacillus、Lysobacter、Pelagivirga、Kocuria和Escherichia與最多的DPP-IV抑制肽相關(guān)（48條），其次是Streptococcus和Peptostreptococcus（47條）。其中P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10分別與21、21、6、22、22、18、21、21、22和19個(gè)微生物菌屬顯著相關(guān)。這幾條DPP-IV抑制肽均為無毒、水溶性好、具有酸性等電點(diǎn)的新型多肽，其中KAGARALTDAETAT（P1）、GEKVDFDDIQK（P2）、VVDADEMYLKGK（P4）和GQKDSYVGDEAQ（P6）穩(wěn)定且無致敏性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 臭鱖魚中DPP-IV抑制肽的形成和抑制機(jī)制

經(jīng)模擬酶切及相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析，DPP-IV抑制肽P1、P2、P4和P6主要由Bacillus、Kocuria、Lysobacter、Lactococcus和Peptostreptococcus產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶（EC 3.4.21.62）、天冬氨酸蛋白酶（EC 3.4.23.1）、嗜熱菌蛋白酶（EC 3.4.24.27）、寡肽酶B （EC 3.4.21.83）和蛋白酶P1（EC 3.4.21.96）酶切形成。分子對(duì)接結(jié)果顯示，DPP-IV抑制肽P1、P2、P4和P6主要與DPP-IV酶中的Arg、Tyr殘基形成鹽橋，與Arg、Asp、Tyr形成常規(guī)氫鍵，與Ser形成碳?xì)滏I，最終使該酶失活。

3 Conclusion

臭鱖魚多肽中共含有278種具有DPP-IV抑制活性的氨基酸殘基，大多數(shù)DPP-IV抑制肽的豐度在發(fā)酵后有所提高，與臭鱖魚多肽提取物的活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。DPP-IV抑制肽KAGARALTDAETAT、GEKVDFDDIQK、VVDADEMYLKGK和GQKDSYVGDEAQ結(jié)構(gòu)中含有眾多活性氨基酸殘基，且本身無毒、水溶性好、穩(wěn)定、無致敏性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這4種DPP-IV抑制肽主要由Bacillus、Kocuria、Lysobacter、Lactococcus和Peptostreptococcus產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、寡肽酶B和蛋白酶P1酶切形成。DPP-IV抑制肽結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)通過與DPP-IV酶中特定的氨基酸殘基形成鹽橋、常規(guī)氫鍵和碳?xì)滏I來發(fā)揮抑制作用。本文研究為今后以鱖魚為原料定向制備特定的高活性DPP-Ⅳ抑制肽提供重要的蛋白酶及其微生物來源信息。

相關(guān)鏈接：脯氨酸，蛋白酶，天冬氨酸，枯草桿菌蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，北納生物

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