姜黃素（Cur）是一種主要存在于姜黃屬植物根莖中的天然二酮類(lèi)化合物，具有多種生理功能，被廣泛用于功能性食品的開(kāi)發(fā)。Cur的溶解性較差，很難被小腸上皮細(xì)胞直接吸收，且其疏水性會(huì)導(dǎo)致其被外排系統(tǒng)排出，難以發(fā)揮應(yīng)有的藥理效應(yīng)。由于蛋白基納米顆粒無(wú)毒、可生物降解以及良好的生物相容性，被公認(rèn)為是一種理想的遞送系統(tǒng)。蛋黃富含蛋白質(zhì)和磷脂等活性物質(zhì)，具有優(yōu)良的油-水界面吸附能力和乳狀液的抗聚結(jié)能力，促使其廣泛應(yīng)用于蛋黃醬、沙拉醬和烘焙食品中。工業(yè)萃取脫磷脂和蛋黃油之后剩下的脫脂蛋黃粉蛋白含量較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%～80%之間，但功能性質(zhì)極差，幾乎不溶于水，無(wú)法直接應(yīng)用于食品工業(yè)。

近日，華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院的在前期研究基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)利用胰蛋白酶水解脫脂蛋黃粉，得到的兩親性EYP在水相中可通過(guò)疏水相互作用自組裝成EYP膠束狀納米顆粒（EYPNs），通過(guò)調(diào)節(jié)pH值控制EYPNs的自組裝行為，進(jìn)而構(gòu)建EYPNs復(fù)合Cur納米顆粒輸送體系，以期擴(kuò)大脫脂蛋黃粉在功能性納米膠體領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

1 EYPNs-Cur的結(jié)構(gòu)表征

通過(guò)pH值誘導(dǎo)共組裝的方法自下而上制備EYPNs-Cur，制備工藝環(huán)保、簡(jiǎn)單，未使用有機(jī)溶劑，且無(wú)需復(fù)雜的分離過(guò)程。通過(guò)將EYPNs溶液pH值調(diào)至12.0，促使EYPNs解離并使Cur實(shí)現(xiàn)足夠程度的質(zhì)子化，增加其溶解度，再將pH值回調(diào)至7.0，誘導(dǎo)EYPNs重新自組裝形成膠束，從而封裝Cur。隨著EYPNs添加量的增加，溶液顏色逐漸變深，表明Cur被包封的量不斷提高。在中性水溶液中，Cur的溶解度很低，經(jīng)測(cè)定僅為0.13 μg/mL，EYPNs具有較強(qiáng)增溶Cur的能力，當(dāng)EYPNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，Cur溶解度（50 μg/mL）明顯提升。隨著EYPNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加（0.5%～4.0%），Cur的包埋率和溶解度不斷升高；當(dāng)EYPNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)，Cur溶解度（434.35 μg/mL）與對(duì)照樣相比提高了3 339 倍，且溶液呈均一、分散狀態(tài)。一般而言，較小的粒徑和絕對(duì)值較高的Zeta電位意味膠體穩(wěn)定性較高。水中游離的Cur粒徑呈雙峰分布，粒徑分別為幾百納米到幾微米，這表明Cur在水中的存在形式為不均勻的聚集體；并且Cur的Zeta電位僅為－6.9 mV，說(shuō)明游離Cur在水相中極不穩(wěn)定。而EYPNs-Cur的粒徑分布均為單峰，平均粒徑為106.9～126.0 nm，Zeta電位為－20 mV左右。綜上，通過(guò)EYPNs自組裝形成的EYPNs-Cur具有優(yōu)異的溶解度和膠體分散性。

游離Cur聚集成大的片狀結(jié)構(gòu)，這是由于游離的Cur在水中幾乎不溶解，以聚集體形式存在；EYPNs-Cur呈球狀結(jié)構(gòu)，平均粒徑約為120 nm，和納米粒度儀測(cè)定結(jié)果基本一致，但也出現(xiàn)了少量不規(guī)則聚集，造成粒徑變大，很有可能是由于自然風(fēng)干過(guò)程引發(fā)EYPNs-Cur出現(xiàn)輕微的聚集。AFM顯示出類(lèi)似的結(jié)果，在游離Cur中觀察到大量微米級(jí)聚集體，這也是游離Cur粒徑測(cè)定時(shí)出現(xiàn)雙峰的原因，EYPNs-Cur復(fù)合物則呈類(lèi)似于球形的納米結(jié)構(gòu)且分布相對(duì)均勻。

凍干后的樣品FE-SEM圖像，游離Cur凍干后進(jìn)一步聚集，形成較為致密的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大量不規(guī)則棒塊狀顆粒，EYPNs-Cur凍干后結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，能觀察到大量球狀納米顆粒，同時(shí)有大塊片狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，可能是由于冷凍干燥過(guò)程造成部分納米顆粒結(jié)構(gòu)的改變。

2 EYPNs和Cur的相互作用分析

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光光譜法是研究水溶液中蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合情況的一種方便的方法。不同Cur添加量對(duì)EYPNs發(fā)射光譜的影響。不添加Cur的純EYPNs溶液中，在280 nm波長(zhǎng)處被激發(fā)后，在350 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)了一個(gè)較高強(qiáng)度的熒光光譜峰。加入少量Cur（10 μg/mL）后，EYPNs的熒光強(qiáng)度即出現(xiàn)大幅減弱，隨著Cur質(zhì)量濃度（10～40 μg/mL）的進(jìn)一步增加，EYPNs的熒光強(qiáng)度逐漸減弱并逐漸猝滅，最大發(fā)射波長(zhǎng)變化不大，這說(shuō)明Cur分子通過(guò)疏水相互作用與EYPNs結(jié)合，但對(duì)于其所處的微環(huán)境無(wú)明顯影響。Cur誘導(dǎo)EYPNs的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

XRD被廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)包埋體系或生物聚合物結(jié)晶度的研究。由游離Cur是高度結(jié)晶結(jié)構(gòu)，EYPNs為無(wú)定形結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的物理混合后，Cur的結(jié)晶峰強(qiáng)度有所減弱，但是大部分衍射峰并沒(méi)有消失，這可能是由于EYPNs會(huì)掩蓋部分Cur造成其衍射峰強(qiáng)度降低；EYPNs-Cur的XRD光譜未顯示任何衍射峰，與EYPNs幾乎完全一致，表明Cur被EYPNs完全封裝。游離Cur在3 510 cm－1處出現(xiàn)的特征吸收峰，對(duì)應(yīng)于Cur中酚羥基（—OH）的拉伸振動(dòng)。物理混合后Cur的多處特征峰（3 510、1 628、870、710 cm－1）有所減弱但是并沒(méi)有消失，這可能是因?yàn)镋YPNs具有較高的峰形，會(huì)掩蓋部分Cur的指紋區(qū)使其特征峰強(qiáng)度降低，這表明物理混合并不會(huì)使EYPNs與Cur發(fā)生相互作用。EYPNs-Cur在3 510 cm－1處的—OH拉伸振動(dòng)峰消失，說(shuō)明Cur和EYPNs之間可能存在氫鍵相互作用。Cur分子在1 427、1 154 cm－1和855 cm－1處的特征峰主要與芳香環(huán)和環(huán)間鏈的振動(dòng)有關(guān)，Cur指紋圖譜區(qū)域（500～1 300 cm－1）吸收峰的強(qiáng)度和數(shù)量在EYPNs-Cur中均出現(xiàn)明顯降低，表明Cur的疏水基團(tuán)可能通過(guò)疏水相互作用與蛋白質(zhì)相互作用。此外，Cur-EYPNs與EYPNs的峰形完全一致，這表明Cur與EYPNs通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合后完全被封裝起來(lái)。

3 EYPNs-Cur的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

在25 ℃下貯藏1 個(gè)月的過(guò)程中，EYPNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%和1.0%時(shí)，EYPNs-Curs的粒徑基本不變，2.0%和3.0% EYPNs組的粒徑略微增加，而4.0% EYPNs組的粒徑快速增加，且在結(jié)束時(shí)增至0 d時(shí)的約2 倍。PDI結(jié)果顯示，除了4.0% EYPNs組增大至0.417，其他樣品都小于0.3，表明樣品具有較為均一的粒徑分布。所有樣品經(jīng)儲(chǔ)存1 個(gè)月后外觀無(wú)明顯變化，未發(fā)生聚集和沉淀，只有4.0% EYPNs組的樣品顏色輕微變淺。以上結(jié)果表明，除4.0% EYPN組的復(fù)合納米顆粒發(fā)生了輕微聚集外，其他樣品都顯示出良好的膠體穩(wěn)定性。

4 EYPNs-Cur的凍干復(fù)溶性

Cur在水溶液中的穩(wěn)定性較差，短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅速發(fā)生降解，并呈pH值依賴性：在pH值為3.0～6.5時(shí)，Cur的半衰期為100～200 min；在pH值為7.2～8.0時(shí)，Cur的半衰期急劇縮短至1～9 min。因此，評(píng)價(jià)Cur在儲(chǔ)存期間的保留率至關(guān)重要。Cur封裝于EYPNs中大大提高了其降解穩(wěn)定性。在25 ℃下不避光貯藏1 個(gè)月后，EYPNs-Cur中的Cur含量基本未發(fā)生改變，只在3.0%、4.0% EYPNs組出現(xiàn)了Cur輕微降解（溶解度分別為322.25～288.00、434.35～393.25 μg/mL）的情況，但其Cur保留量依然高達(dá)90%左右。這主要是由于當(dāng)EYPNs荷載的Cur量較大時(shí)，在25 ℃透明玻璃瓶中不可避免地受光照的影響使部分Cur發(fā)生降解。本研究中構(gòu)建的EYPNs-Cur可以有效保護(hù)Cur免受光照和氧化劑等的影響而降解?？赡艿姆€(wěn)定機(jī)制如下：一方面歸因于兩親性EYP自身具有一定的抗氧化能力；另一方面，EYPNs與Cur相互作用所結(jié)合，起到了“固定”Cur的作用，降低其遷移率，從而降低了其化學(xué)反應(yīng)性；此外，結(jié)合XRD結(jié)果，Cur被完全封裝于EYPNs的膠束內(nèi)部，形成了物理屏障，從而保護(hù)Cur不被降解。

在室溫25 ℃不避光條件下，EYPNs-Cur已經(jīng)顯示出良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，但較高濃度納米顆粒的粒徑會(huì)有所增加，為了更好地實(shí)現(xiàn)納米顆粒的長(zhǎng)期穩(wěn)定，進(jìn)一步考察低溫貯藏條件下EYPNs-Cur的粒徑分布及Cur溶解度變化情況，結(jié)果如圖5所示。所有樣品在4 ℃下貯藏1 個(gè)月后，粒徑均無(wú)明顯變化，范圍為105～135 nm，且PDI變化也很小，PDI最高不超過(guò)0.24，這表明在低溫條件下儲(chǔ)存，所有樣品都具有優(yōu)異的膠體穩(wěn)定性。此外，EYPNs-Cur的外觀在儲(chǔ)存1 個(gè)月后與第1天相比無(wú)肉眼可見(jiàn)的差異。所有復(fù)合納米顆粒的Cur幾乎沒(méi)有發(fā)生降解，表明低溫貯藏能有效抑制Cur的降解，這主要是由于低溫可以抑制復(fù)合納米顆粒奧斯瓦爾德熟化過(guò)程和降低Cur的氧化速率。

5 EYPNs-Cur的凍干復(fù)溶性

本實(shí)驗(yàn)考察了凍干后EYPNs-Cur的粒徑分布和Cur溶解性情況，以評(píng)估EYPNs-Cur的凍干穩(wěn)定性。與凍干前相比，復(fù)溶后的EYPNs-Cur溶液外觀無(wú)明顯變化，整體均一澄清，無(wú)肉眼可見(jiàn)的聚集、沉淀出現(xiàn)，呈現(xiàn)出良好的再分散性，且同一EYPNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)組的樣品復(fù)溶后的溶解性與凍干前無(wú)明顯差異。粒徑分布的結(jié)果也與凍干前基本一致，這表明凍干過(guò)程對(duì)復(fù)合納米顆粒的膠體分散性沒(méi)有明顯影響，未引發(fā)不可逆的顆粒聚集。因此，本研究制備的EYPNs-Cur可適用于多種應(yīng)用場(chǎng)景，并且具有保存和運(yùn)輸條件上的優(yōu)勢(shì)。

6 EYPNs-Cur的生物可及性

在消化過(guò)程中脂溶性物質(zhì)經(jīng)過(guò)膽酸鹽乳化后，可形成穩(wěn)定的復(fù)合膠束并通過(guò)小腸細(xì)胞屏障進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)到血液循環(huán)中參與多種生命活動(dòng)。Cur的生物可及性主要取決于其在消化液中的溶解性，Cur含量越高表示其生物可及性越高。游離Cur和EYPNs-Cur在整個(gè)模擬消化過(guò)程中Cur保有量的變化，在模擬胃消化階段，游離Cur和復(fù)合納米顆粒在消化液中的生物可及性均較低，分別為0.3%～0.6%和4.4%～4.9%，雖然在數(shù)值上并不高，但EYPNs-Cur卻顯著高于游離Cur。在模擬腸消化階段，兩組樣品在消化液中的Cur保有量均增大，游離Cur和EYPNs-Cur中的Cur生物可及性分別為30.2%～40.9%和66.3%～73.6%。相較于游離Cur，自組裝形成EYPNs-Cur后，Cur的生物可及性提高近1 倍，這表明EYPNs-Cur可以顯著提高Cur的生物可及性。值得注意的是，EYPNs-Cur在模擬消化過(guò)程中依然有約30%的Cur未得到利用，原因可能是EYPNs在長(zhǎng)達(dá)1 h酸性條件下發(fā)生聚集并導(dǎo)致復(fù)合納米顆粒沉淀。此外，胃蛋白酶也會(huì)水解部分EYPNs使EYPNs-Cur失穩(wěn)并釋放部分Cur，而Cur在酸性環(huán)境中溶解性較差。整體來(lái)看，將Cur包載于EYPNs中能大幅提升其在消化液中，增加其生物可及性。就EYPNs-Cur而言，如果采用特定的材料封裝讓其安全穿過(guò)胃并進(jìn)入腸道內(nèi)釋放，其生物可及性將會(huì)大幅度提高。

7 結(jié) 論

本研究采用工業(yè)生產(chǎn)蛋黃卵磷脂和蛋黃油產(chǎn)生的副產(chǎn)物脫脂蛋黃蛋白粉為原料，通過(guò)胰蛋白酶水解得到兩親性EYP及其自組裝形成的膠束狀納米顆粒（EYPNs），用于構(gòu)建穩(wěn)定的共組裝EYPNs-Cur復(fù)合納米顆粒輸送體系。結(jié)果表明，EYPNs和Cur之間存在較強(qiáng)的疏水相互作用，Cur通過(guò)與EYPNs共組裝形成納米顆粒對(duì)Cur進(jìn)行包埋，可使Cur溶解度大幅提高，同時(shí)使其即使經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)1 個(gè)月的不避光貯藏也不發(fā)生降解。此外，Cur與EYPN共組裝后的體外消化生物可及性大幅提高，由30.2%～40.9%增加至66.3%～73.6%。本研究表明，由兼具生物活性與兩親性的EYP自組裝形成的納米膠束顆粒是一種新型高效的納米遞送載體，可大幅提升疏水性功能因子的水溶性、穩(wěn)定性和生物可及性，在功能性食品與營(yíng)養(yǎng)品以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

相關(guān)鏈接：姜黃素，胰蛋白酶，小腸上皮細(xì)胞，蛋黃卵磷脂，淀粉，蛋白質(zhì)，北納生物

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