度米芬為季銨鹽類陽離子型表面活性消毒防腐劑，對革蘭陽性、陰性細(xì)菌及真菌均有殺滅作用，以前常作為藥物用于口腔、咽喉感染的輔助治療，現(xiàn)廣泛用于消毒殺菌產(chǎn)品中。2002版《消毒技術(shù)規(guī)范》沒有規(guī)定其含量檢測的方法。目前度米芬含量檢測方法的研究主要集中在藥物中度米芬的檢測， 文獻(xiàn)報道的方法有鉻酸鉀指示劑法、紫外分光光度法、薄層掃描法、離子對比色法等，這些方法在實際操作中干擾大、專屬性不強(qiáng)，檢測結(jié)果不理想；高效液相色譜法多參考 2015 版《中國藥典》方法，該方法采用離子交換樹脂色譜柱，實際操作中耐用性較差，且色譜峰飄移嚴(yán)重。因此建立一種操作簡單，通用性強(qiáng)，可用于檢測消毒產(chǎn)品中度米芬含量的方法具有重要意義。

筆者選用 C18 色譜柱，建立了反相高效液相色譜法測定消毒凝膠劑中度米芬的含量，并將該方法用于含度米芬的口腔抑菌噴液、婦炎凈洗液、足廯凈噴霧劑、寶寶膚康凝膠多種樣品的測定，結(jié)果顯示，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，通用性強(qiáng)。

1　實驗部分

1.1　主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：UltiMate3000 型；

電子天平：(1)XP56 型，感量為 0.001mg，(2)BSA224 型，感量為 0.0001g；

超純水系統(tǒng)：Dura12 型；

度米芬對照品：純度為 99.9%，批號為 100455–200401；

甲醇、乙腈：色譜純；

十二烷基硫酸鈉、磷酸二氫鈉：分析純；

磷酸、三乙胺：優(yōu)級純；

消毒凝膠及陰性制劑；

口腔抑菌噴液、婦炎凈洗液、足廯凈噴霧劑、寶寶膚康凝膠樣品：委托檢驗樣品；

實驗用水為超純水。

1.2　溶液配制

1.2.1　度米芬對照品溶液

用電子天平 (1) 精密稱取度米芬對照品 10.855mg，置于 25 mL 容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，得 0.434 2 mg／mL 的度米芬對照品溶液，于 4℃冰箱中保存。

1.2.2　樣品溶液

取樣品約 5.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密吸取流動相 50 mL 對樣品進(jìn)行稀釋，稱量，超聲 15 min 后，再稱量，用流動相補(bǔ)足減失質(zhì)量，過濾膜，即得樣品溶液。

1.2.3　陰性空白溶液

取不含度米芬陰性消毒凝膠，按 1.2.2 樣品溶液制備方法制備陰性空白溶液。

1.3　色譜條件

色譜柱：Shim-Pack VP–ODS C18 柱 (250 mm×4.6mm，5 μm) ；檢測波長：269nm ；柱溫：35℃；流動相：0.012 mol／L 十二烷基硫酸鈉 ( 每 1 L 加 5 g 磷酸二氫鈉及 4 mL 三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)–乙腈–甲醇(2∶6∶2)，流量為1.5mL／min ；進(jìn)樣體積：10 µL。

2　結(jié)果與討論

2.1　樣品溶媒的選擇

分別選擇水、甲醇、70% 乙醇和流動相［十二烷基硫酸鈉–乙腈–甲醇 (2∶6∶2)］作為樣品溶媒進(jìn)行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的溶媒對凝膠消毒劑中度米芬溶出結(jié)果影響不同，影響由大到小依次為流動相、甲醇、水、70%乙醇，這與基質(zhì)溶解度及酸堿性有很大的關(guān)系，綜合考慮選擇以流動相作為樣品溶液溶媒，這樣既能使度米芬完全溶出又 能使基線平穩(wěn)。

2.2　流動相的選擇

度米芬為陽離子型藥物，有文獻(xiàn)報道采用 C18 色譜柱進(jìn)行含量測定［12–13］，以0.012 mol／L 十二烷 基硫酸鈉–乙腈(25∶75)為流動相，實際操作時發(fā) 現(xiàn)，度米芬色譜峰明顯拖尾，故在該流動相體系中加 入三乙胺作為掃尾劑，當(dāng) 1 L 水相中含 4 mL 三乙胺 時，度米芬的色譜峰無明顯拖尾。參考中藥化學(xué)成 分研究中的三元流動相系統(tǒng) ，在原有的兩元流 動相系統(tǒng)中引入甲醇，并調(diào)整比例對色譜峰進(jìn)行優(yōu)化，十二烷基硫酸鈉、乙腈、甲醇的體積比為 2∶6∶2 時，色譜分離度佳且度米芬色譜峰對稱性好。

2.3　色譜柱的選擇

分別選擇 5 種不同品牌、型號及柱長的 C18 色譜 柱：Inertsil ODS–3 柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，Phenomenex synergi polar 柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)，Kromasil柱 (200 mm×4.6 mm，5 μm)，HypersilODS–2 柱 (250 L×4.6 mm，5 μm)，Shim-Pack VP–ODS 柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，在 1.3 色譜條件下進(jìn)行比對試驗，結(jié)果表明，在 5 種色譜柱中度米芬色譜峰保留時間均穩(wěn)定，且無雜質(zhì)干擾，該方法對色譜柱的選擇性無特殊要求。由于 Shim-Pack VP–ODS柱相對其它兩種色譜柱性能穩(wěn)定，耐用、通用性強(qiáng)，故選擇 Shim-Pack VP–ODS 柱。

2.4　系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取對照品溶液、樣品溶液及陰性空白溶液 10 μL，依次注入液相色譜儀進(jìn)行測定，色譜圖如圖 1 所示。

由圖 1(a)可知，對照品溶液中度米芬色譜峰與其它雜峰完全分離（色譜峰理論塔板數(shù) n=13 030）；樣品溶液中度米芬色譜峰與其它雜峰完全分離，且峰形對稱；陰性空白溶液中度米芬色譜峰峰形較好，無干擾峰。

2.5　線性關(guān)系與檢出限

精密吸取度米芬對照品溶液 0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為 0，86.84，173.68，260.52，374.36，434.20 µg／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在 1.3 色譜條件下分別進(jìn)樣測定。以度米芬的質(zhì)量濃度 (X) 為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積 (Y) 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得線性方程為Y=0.019 7X+0.000 4，線性范圍為 0～434.20 µg／mL，相關(guān)系數(shù) r=1。以信噪比 S／N ≥ 3 時對應(yīng)的度米芬質(zhì)量濃度確定檢出限，得方法檢出限為 0.13 µg／mL。

2.6　儀器精密度試驗

精密吸取供試品溶液 10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄色譜峰面積，結(jié)果見表 1。由表 1 可知，色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.17%，表明儀器的精密度良好。

2.7　穩(wěn)定性試驗

精密稱取樣品 5.0 g，按 1.2 方法制備供試品溶液，分別放置 0，2，4，6，8，10 h 后在 1.3 色譜條件下進(jìn)樣測定，測定結(jié)果見表2。

由表 2 可知，度米芬色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.08%，表明供試品溶液在 10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8　方法精密度試驗

精密稱取樣品 5.0 g，共 6 份，按 1.2 方法制備樣品溶液，在 1.3 色譜條件下分別測定，測定結(jié)果見表3。由表 3 可知，度米芬峰測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.13%，表明該方法的精密度良好。

2.9　加標(biāo)回收試驗

精密稱取已知度米芬含量的樣品 2.5 g，分別精密加入相當(dāng)于含有 80%，100%，120% 度米芬的對照品溶液適量，按照 1.2 方法配制樣品溶液，在 1.3 色譜條件下測定，結(jié)果見表 4。由表 4 可知，度米芬平均回收率為 97.80%，說明所建方法的準(zhǔn)確度較高。

2.10　實際樣品分析

按照 1.2 方法制備消毒凝膠劑（3 批）、口腔抑 菌噴液、婦炎凈洗液、足廯凈噴霧劑、寶寶膚康凝膠 產(chǎn)品的樣品溶液，按實驗方法進(jìn)行測定，得度米芬含 量測定結(jié)果見表 5。由表 5 可知，消毒樣品中度米 芬測定結(jié)果均在標(biāo)示量范圍內(nèi)。

3　結(jié)語

通過不同供試品溶液溶媒、不同色譜柱的比較，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗及高效液相色譜法方法學(xué)的驗證，建立了反相高效液相色譜法測定消毒凝膠中度米芬含量的方法。該方法樣品處理簡單，靈敏度高，耐用性強(qiáng)，重復(fù)性好，通用性強(qiáng)，可廣泛用于消毒殺菌產(chǎn)品中度米芬的含量測定。