奧曲肽 (Octreotide，OCT) 是由八個氨基酸組成的環(huán)狀多肽化合物，化學(xué)名稱為 D- 苯丙胺酰 -L-半胱氨酰 -L- 苯丙胺酰 -D- 色氨酰 -L- 賴氨酰 -L-蘇氨酰 -L- 半胱氨酰 -L- 蘇氨醇 (2 → 7) 環(huán)二硫化物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖 1 所示。OCT 是首例獲批上市的人工合成生長抑素類藥物，與天然生長抑素(Somatostatin, SST) 相比，具有更強的作用效果與更長的半衰期，對腺體分泌 ( 生長激素、促甲狀腺激素、胰島素、胰高血糖素、降鈣素等 )、內(nèi)臟血流、平滑肌收縮、細胞增殖、腫瘤增長等具有抑制作用，是目前臨床上治療肢端肥大癥的首選藥物，同時在治療急慢性胰腺炎、上消化道出血、消化道內(nèi)分泌／非內(nèi)分泌性腫瘤、肺癌等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近年來，OCT 原料藥合成、新劑型開發(fā)、藥理學(xué)等研究備受關(guān)注，而上述研究均需要以 OCT 的定量析作為依據(jù)。

目前 OCT 定量分析方法主要有高效液相色譜(HPLC) 法、高效液相色譜 – 質(zhì)譜 (HPLC–MS)法、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 法、放射性免疫分析 (RIA) 法、共振瑞利散射 (RRS) 法等。其中，HPLC 法設(shè)備費用相對較低，操作較簡單，在 OCT 原料藥及其制劑純度與雜質(zhì)分析、載藥量、穩(wěn)定性、質(zhì)量一致性、體外溶出度等評價中應(yīng)用最為廣泛。目前文獻報道的關(guān)于奧曲肽的 HPLC定量分析方法主要是參照《中國藥典》中醋酸奧曲肽 (Octreotide Acetate，OA) 測定含量的方法，即采用不同濃度的四甲基氫氧化銨水溶液和不同體積的乙腈分別作為流動相 A 和流動相 B，然后進行梯度洗脫。該方法存在流動相配制繁瑣、分析時間長( 大于 30 min)、壓力不穩(wěn)定、基線噪聲和漂移大影響分析精密度和穩(wěn)定性、色譜柱需要再生處理、磷酸鹽容易析出損壞色譜柱與柱塞泵等不足。筆者采用乙腈 – 固定濃度的高氯酸水溶液體系等度洗脫，分別考察了流動相 pH 值和配比對 OCT 色譜行為的影響，優(yōu)化相關(guān)色譜條件，建立了新的 HPLC 定量分析 OCT 的方法，該方法操作簡便，測定快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于 OCT 原料藥與制劑的分析評價。

1　實驗部分

1.1　主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 型；

電子分析天平：XP105DR 型；

酸度計：Sevenmulti 型；

奧曲肽標(biāo)準(zhǔn)品：純 度 為 99.1%，批 號 為2018053003–1；

奧曲肽原料藥樣品；

乙腈：色譜純；

高氯酸：分析純；

1.2　色譜條件

色 譜 柱：Eclipse plus C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司 ) ；流動相：乙腈 –0.25% 高氯酸水溶液 ( 體積比為 30∶70) ；檢測波長：210 nm ；流量：1 mL／min ；柱溫：25℃；進樣體積：5 μL。

1.3　溶液配制

OCT 儲備溶液：219.0 μg／mL，精確稱取 21.9 mg 奧曲肽標(biāo)準(zhǔn)品，置于 100 mL 容量瓶中，加入適量純水溶解并定容至標(biāo)線，搖勻。

系列 OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密移取 0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，10.0 mL 的 OCT 儲 備 溶 液 至10 mL 容量瓶中，加入純水稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成奧曲肽的質(zhì)量濃度分別為 4.38，10.95，21.90，43.80，87.60，131.40，219.00 μg／mL 的 系 列OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4　樣品處理

精確稱取 20 mg 奧曲肽原料藥樣品，置于 250 mL 容量瓶中，加入適量純水溶解，超聲 5 min，冷卻后用純水定容至標(biāo)線，搖勻，靜置后用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液即為待測樣品溶液。

2　結(jié)果與討論

2.1　流動相 pH 值確定

在乙腈 – 高氯酸水溶液體積比為 30∶70 條件下，通過改變高氯酸水溶液中高氯酸含量，配制 pH 0.6 至 pH 6.4 的系列流動相體系，考察流動相 pH 值 對 OCT 色譜行為的影響，結(jié)果見表 1。

由表 1 可知，當(dāng)流動相 pH ≥ 2.24 時，OCT 主峰與溶劑峰不能完全分離；當(dāng)流動性 pH 值≤ 1.94時，OCT 主峰與溶劑峰完全分離，隨流動相 pH 值的減小，OCT 的保留時間逐漸延長，色譜峰的對稱性和峰寬逐漸增加，峰高逐漸減小，峰面積無顯著差異。當(dāng)高氯酸含量為 0.25%，即流動相體系的 pH值為 1.7 時，pH 對 OCT 色譜行為影響較小，OCT主峰保留時間小于 9 min，且峰形尖銳、對稱性良好。綜合保留時間、峰形對稱性、峰高、峰寬等因素選擇在高氯酸水溶液中加入 0.25% 高氯酸，即流動相 pH值為 1.7。

2.2　流動相配比對選擇

分別以體積比為10∶90，20∶80，25∶75，30∶70，35∶65，40∶60 的乙腈 –0.25% 高氯酸水溶液作為流動相進樣分析，考察不同流動相配比對 OCT 色譜行為的影響，上述流動相體系的pH 值均在 1.70±0.05之間，在此范圍內(nèi) pH 對 OCT 色譜行為影響較小，實驗結(jié)果如圖 2 所示。

由圖 2 可以看出，隨著流動相體系中乙腈體積分數(shù)的增大，OCT 的保留時間隨之減小。當(dāng)乙腈與0.25% 高氯酸水溶液體積比為 10∶90 和20∶80 時，流動相洗脫能力不夠，30 min 內(nèi)未出峰。當(dāng)二者的體積比為 25∶75，30∶70，35∶65 時，OCT 主峰與溶劑峰完全分離，保留時間分別為 14.45，8.92，4.56 min，其中，當(dāng)二者的體積比為 30∶70 時，色譜峰峰形尖銳，且對稱性最好。當(dāng)二者的體積比為 40∶60時，OCT 主峰與溶劑峰不能完全分離。綜合考慮，選擇體積比為 30∶70 的乙腈 – 0.25％高氯酸水溶液作為流動相，OCT 的保留時間為 8.92 min，色譜圖如圖 3 所示。

2.3　線性方程與檢測限

將系列 OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，在 1.2 色譜條件下分別進行測定，每一濃度的 OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)進樣 2 次，以兩次測定值的平均值作為色譜峰面積的測定結(jié)果。以O(shè)CT 的質(zhì)量濃度 (X) 為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算得線性方程為Y=11.579X–31.461，相關(guān)系數(shù)為 0.999 9。表明 OCT的質(zhì)量濃度在 4.38～219 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

將質(zhì)量濃度為 4.38 μg／mL 的 OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐步稀釋，在 1.2 色譜條件下分別進樣測定，計算相應(yīng)色譜峰高和平均基線噪音之比。以 3 倍信噪比 (S／N=3) 時的濃度為最低檢測限濃度，以 10 倍信噪比 (S／N=10) 時的濃度為最低定量限濃度，將檢測限濃度乘以進樣體積 5 μL，得最低定性與定量檢測限分別為 1.10，2.19 ng。

2.4　精密度試驗

按 1.4 方法分別對 5 份奧曲肽原料藥樣品進行處理，得到 5 組不同質(zhì)量濃度的 OCT 樣品溶液，在1.2 色譜條件下分別連續(xù)進樣測定 5 次，結(jié)果見表 2。

由表 2 可知，5 組不同質(zhì)量濃度的 OCT 樣品測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.26%～0.46%，表明該方法精密度良好。

2.5　加標(biāo)回收試驗

分別將含有 180，300，600 μg 奧曲肽的溶液樣品添加到空白樣品基質(zhì) ( 純水 ) 中，定容配制成低、中、高 3 種加標(biāo)濃度的樣品，經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜過濾后，在 1.2 色譜條件下進行測定，每個濃度樣品平行測定 3 次，根據(jù)色譜峰面積及線性方程計算回收率，結(jié)果見表 3。由表 3 可知，樣品加標(biāo)回收率為97.41%～100.26%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.6　穩(wěn)定性試驗

選取質(zhì)量濃度分別為 10.95，43.80，219.00 μg／mL 的 OCT 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在 1.2 色譜條件下，分別通過在一天內(nèi)每隔 2 h 測定一次、共計 5 次和每天測定一次、連續(xù)測定 5 天的方式，考察分析方法的日內(nèi)與日間穩(wěn)定性，結(jié)果見表 4。日內(nèi)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.32%～0.37%，日間測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.47%～1.31%. 表明該方法具有較高的穩(wěn)定性。

2.7　實際樣品測定

按 1.4 方法分別對實驗室制備的 5 個批次的奧曲肽原料藥樣品進行處理，在 1.2 色譜條件下，對每個樣品平行測定 3 次，取平均值作為測定結(jié)果，根據(jù)色譜峰面積及線性方程計算得 5 個批次原料藥樣品中奧曲肽含量分別為 98.3%，98.2%，98.0%，98.7%，98.2%。表明所制備的原料藥具有較高的純度與良好的批次穩(wěn)定性。

3　結(jié)語

建立了以乙腈 – 高氯酸水溶液為流動相體系的奧曲肽等度洗脫 HPLC 定量分析方法，著重考察了流動相 pH 值及配比對 OCT 色譜行為的影響，與常規(guī)藥典方法相比，避免了含有磷酸的復(fù)雜流動相體系以及梯度洗脫存在的不足。該方法操作簡便，檢測快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于 OCT 原料藥與制劑的分析評價，以促進 OCT 的藥學(xué)研究與臨床應(yīng)用。