在對熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行分析時首先要了解幾個概念：

　　基線（Baseline）指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。

　　光域值threshold的設(shè)定，一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。

    CT值表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小，反之亦然。

　　融解曲線是用來驗證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的，如果產(chǎn)物是單一條帶，融解曲線就會出現(xiàn)一尖峰；如果有引物二聚體或其它非特異性擴(kuò)增，就會出現(xiàn)至少兩個尖峰。

Real-Time qPCR 常見問題分析

1.無Ct值出現(xiàn)

1）檢測熒光信號的步驟有誤：一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號；

2）引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；

3）模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起；

4）模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

2.Ct 值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

1）擴(kuò)增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，設(shè)計更好的引物或探針、改用三步法 進(jìn)行反應(yīng)、適當(dāng)降低退火溫度、增加鎂離子濃度等；

2）PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不足，

3）PCR產(chǎn)物太長：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

1）加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；

2）標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；

3）引物或探針不佳：重新設(shè)計更好的引物和探針；

4）模板中存在抑制物，或模板濃度過高。

4.負(fù)對照有信號、溶解曲線不止一個主峰

1）引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；

2）引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比；

3）鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒；

4）模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA 的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴(kuò)增。

5.擴(kuò)增效率低

1）反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解；

2）反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法；

3）反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。