摘要  G蛋白偶聯(lián)受體( G protein-coupled receptors，GPCRs )是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最大的細(xì)胞膜表面受體家族,具有7次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。人類基因組編碼約800種不同類型的GPCRs,廣泛參與了代謝性疾病及腫瘤等多種重大疾病的病理過(guò)程,使之成為藥物研發(fā)的熱門靶點(diǎn)。肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類物質(zhì),由兩個(gè)至幾十個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成,是涉及生物體內(nèi)多種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。迄今為止,研究者已鑒定出7 000余種天然肽,分別作為激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、離子通道配體和抗生素等發(fā)揮功能。肽類藥物因具有作用機(jī)制明確、安全性好、生產(chǎn)成本低等多重獨(dú)特優(yōu)勢(shì)及其在空間結(jié)構(gòu)上近乎無(wú)限的可能性而逐漸受到重視。

近年來(lái),基于對(duì)CPCR結(jié)構(gòu)的理解不斷深入,靶向GPCR的肽類藥物發(fā)展迅猛,新藥不斷上市。目前為止,美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)已批準(zhǔn)上市近50種靶向CPCR的肽類藥物,用于治療代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等多種疾病。肽類藥物的研發(fā)經(jīng)歷了人體肽開(kāi)發(fā)、天然肽開(kāi)發(fā)和生物技術(shù)開(kāi)發(fā)3個(gè)階段。目前,已上市的靶向GPCR肽類藥物大多是對(duì)人體天然內(nèi)源性多肽類配體的改造與修飾。本文歸納了近年來(lái)研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物,并簡(jiǎn)要總結(jié)了目前肽類藥物的研發(fā)策略及未來(lái)潛在的發(fā)展方向,旨在為更多靶向GPCR肽類藥物的研發(fā)提供參考。

作為人體內(nèi)最大的細(xì)胞膜表面受體家族,G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors，GPCRs)參與了包括糖尿病、心血管疾病、自身免疫病、腫瘤等在內(nèi)的多種重大疾病的病理過(guò)程。靶向CPCR藥物的開(kāi)發(fā)一直是藥物研發(fā)的熱點(diǎn),美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的全部藥物中有超過(guò)1/3都以GPCR為作用靶點(diǎn)。肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類物質(zhì),由2個(gè)至幾十個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成。迄今為止,已鑒定出7000余種天然肽,分別作為激素,神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子,離子通道配體和抗生素等發(fā)揮功能。在人體內(nèi),肽類參與多種重要生理過(guò)程:例如胰島素( insulin)促進(jìn)糖原、脂肪和蛋白質(zhì)的合成代謝,發(fā)揮降血糖的作用;又如催產(chǎn)素( oxytocin)在分娩過(guò)程中促進(jìn)子宮平滑肌的收縮,并刺激乳腺射乳反應(yīng)。肽作為一類信號(hào)分子,通過(guò)結(jié)合細(xì)胞膜表面受體,例如GPCRs ,離子通道( ion channels)等,啟動(dòng)特定的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。近年來(lái),肽類藥物逐漸引起醫(yī)藥界的重視,其憑借生物活性高、安全性好、生產(chǎn)成本低等特性及其在空間結(jié)構(gòu)上近乎無(wú)限的可能性被視為藥物研發(fā)的新增長(zhǎng)點(diǎn)。在本篇綜述中,歸納了研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物,并簡(jiǎn)要總結(jié)了目前肽類藥物的研發(fā)策略和未來(lái)可能的發(fā)展方向。

1 G蛋白偶聯(lián)受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

人類基因組編碼超過(guò)800種 GPCR,其配體可以是小分子糖類、脂質(zhì)和多肽,也可以是蛋白質(zhì)等生物大分子。GPCR的共同特點(diǎn)是其立體結(jié)構(gòu)包含7個(gè)跨膜α螺旋,因此又被稱為7次跨膜受體,同時(shí)其胞內(nèi)區(qū)有G蛋白(鳥苷酸結(jié)合蛋白)結(jié)合位點(diǎn)7。根據(jù)其結(jié)構(gòu)的相似性,GPCR可被分為5類,分別是:視紫紅質(zhì)樣家族( rhodopsin-like family)、分泌素受體( secretin receptors )、代謝型谷氨酸受體( metabotropic glutamate receptors)、黏附素受體( ad-hesion receplors)以及Frizzled/Taste2受體( Frizzled/'Taste2 receptors )。2012年,諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了美國(guó)科學(xué)家Robert J. Lefkowitz和 Brian K. Kobilka ，以表彰他們?cè)贑PCR功能及結(jié)構(gòu)研究中的突出貢獻(xiàn)。他們的工作推動(dòng)了CPCR結(jié)構(gòu)生物學(xué)的大發(fā)展,新的GPCR 結(jié)構(gòu)不斷被解析公布,使人們對(duì)GPCR的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性及其信號(hào)傳導(dǎo)的復(fù)雜性有了更深入的認(rèn)識(shí)。

經(jīng)典的GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由C蛋白介導(dǎo)。G蛋白是由Ga 、Gp.Gy三個(gè)亞基組成的異源三聚體。其中 ,Gα 亞基是具有GIP酶活性的分子開(kāi)關(guān)蛋白質(zhì),Gβ和Gy則以二聚體形式緊密結(jié)合。Gα有4種亞型:Go..Gx;,. .Gαg和 Gorws。每種亞型結(jié)合不同的效應(yīng)器蛋白質(zhì),效應(yīng)器蛋白質(zhì)可以直接或通過(guò)第二信使進(jìn)一步激活下游效應(yīng)(見(jiàn)Table 1 )。

以Gα.為例:CPCR與配體結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變,活化的受體與G蛋白三聚體α亞基結(jié)合,導(dǎo)致Go亞基上的GDP與胞質(zhì)中的GTP交換, Go亞基與受體和Gβy亞基解離,結(jié)合并激活腺苷酸環(huán)化酶( adenylate cyclase，AC) ,進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)濃度增高，cAMP與蛋白質(zhì)激酶A( protein kinase A，PKA)調(diào)節(jié)亞基結(jié)合,導(dǎo)致催化亞基被釋放并入核,使cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白質(zhì)(CREB)磷酸化,磷酸化的CREB與核內(nèi)CREB結(jié)合蛋白質(zhì)(CBP)特異結(jié)合形成復(fù)合物,復(fù)合物與靶基因調(diào)控序列結(jié)合,激活靶基因轉(zhuǎn)錄。分離的Gβy亞基也可以激活下游效應(yīng)分子,例如磷脂酶C( phospholipase C，PLC), PLC可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸( phosphatidylinositol-4,5-bi-sphosphate，PIP,)水解成第二信使肌醇三磷酸( inositol-1 ,4 ,5-trisphosphate，IP,)和二酰甘油( di-acylglycerol，DAG)——IP。刺激細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),使胞內(nèi)Ca*濃度升高;DAG激活蛋白質(zhì)激酶C( protein kinase C，PKC) ,進(jìn)而觸發(fā)MAPK(mitogen activated protein kinase)信號(hào)通路(見(jiàn)Fig.1)。

GPCR另一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制由GPCR激酶( CRKs)和抑制蛋白( arrestin)介導(dǎo)。GPCR與GRKs結(jié)合導(dǎo)致受體磷酸化,從而終止 GPCR 與G蛋白的相互作用;同時(shí), CPCR磷酸化還啟動(dòng)GPCRs與β-抑制蛋白結(jié)合。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,β-抑制蛋白是作為GPCR信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制存在的。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),其也能啟動(dòng)非G蛋白依賴的下游信號(hào)通路。某些配體與GPCR結(jié)合可導(dǎo)致受體選擇性與不同亞型的G蛋白或β-抑制蛋白相互作用,從而有偏向性地激活某些特定的信號(hào)通路,這些配體被稱為“偏向性配體”。具有偏向性的配體與受體結(jié)合可激活β-抑制蛋白通路,β-抑制蛋白可以與許多下游效應(yīng)蛋白質(zhì)相互作用,例如MAPK 、PKB( protein kinase B)等,在 GPCR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這一發(fā)現(xiàn)為靶向GPCR藥物的研發(fā)提供了新的方向;具有偏向性的配體能特異性地激活G蛋白或者β-抑制蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路,相比傳統(tǒng)配體其表現(xiàn)出更強(qiáng)的靶向性,這對(duì)提高藥效有重要的意義。

2 肽類藥物及其研發(fā)策略

多肽作為藥物具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):( 1)大量天然肽類可作為配體作用于細(xì)胞膜表面受體。據(jù)此開(kāi)發(fā)的肽類藥物作用機(jī)制明確、生物活性高、用藥劑量小;(2)與小分子藥物相比,肽類藥物不通過(guò)肝的代謝,其代謝產(chǎn)物為氨基酸,幾乎無(wú)毒性且一般不會(huì)在特定器官組織中累積,因此副作用發(fā)生率低,安全性好;(3)與蛋白質(zhì)等生物大分子相比,肽類藥物易于合成,容易與雜質(zhì)或副產(chǎn)品分離,純度高,且其研發(fā)周期短,生產(chǎn)成本低,易滿足中等規(guī)模治療的需要。鑒于這些良好的藥理特性和固有優(yōu)勢(shì),肽類藥物成為近年來(lái)新藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。目前,已有50多種靶向GPCR肽類藥物被美國(guó)FDA批準(zhǔn),其中大多數(shù)用于代謝性疾病或腫瘤的治療,肽類藥物的研發(fā)經(jīng)歷了人體肽開(kāi)發(fā)、天然肽開(kāi)發(fā)和生物技術(shù)開(kāi)發(fā)3個(gè)階段。最初的關(guān)注點(diǎn)集中于對(duì)人體肽類激素的開(kāi)發(fā)和利用。目前,上市的藥物大多都是用這個(gè)策略合成的,最為典型的例子是胰島素。上世紀(jì)80 ~90年代,研究者利用重組DNA技術(shù)制造出高純度的生物合成人胰島素,并通過(guò)對(duì)肽鏈進(jìn)行修飾合成了胰島素類似物,實(shí)現(xiàn)了速效和長(zhǎng)效。上世紀(jì)末,研究人員將探索范圍擴(kuò)大到存在于微生物、植物、動(dòng)物毒液中的天然肽類。例如，用于2型糖尿病及肥胖癥治療的Exendin-4。繼對(duì)天然肽類的大規(guī)模挖掘之后,肽類藥物的研發(fā)走上了利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行篩選和開(kāi)發(fā)的必由之路。

利用分子生物學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)肽類藥物的兩大基礎(chǔ)是高豐度肽庫(kù)的建立和合適的篩選策略。1985年，George P Smith通過(guò)將肽段融人噬菌體表面蛋白質(zhì)，開(kāi)發(fā)出了噬菌體展示技術(shù)( phage display)。1990年,George P Smith 與 Jamie K Scott將隨機(jī)序列肽展示在噬菌體表面,建立了噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)。噬菌體展示技術(shù)通過(guò)多輪親和篩選,可在高豐度隨機(jī)肽庫(kù)(豐度可達(dá)10°)中篩選出與靶蛋白質(zhì)具有高親和力的肽段,通過(guò) DNA測(cè)序確定候選肽的編碼信息,從而將肽段與靶蛋白質(zhì)的親和力屬性( pheno-type ，affinity )與肽段遺傳信息( genotype，DNA se-quence)相關(guān)聯(lián)。隨后,新的mRNA展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和酵母展示技術(shù)等不斷涌現(xiàn),它們與噬菌體展示技術(shù)一起在過(guò)去20年中不斷得到發(fā)展與優(yōu)化,理論上能夠針對(duì)任何靶蛋白質(zhì)進(jìn)行基于親和力的高通量篩選。

2014年,美國(guó)Scripps研究所Lerner課題組利用一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的自分泌信號(hào)系統(tǒng)( auto-crine-based signaling system) ,成功篩選出GLP-1R的新型肽類激動(dòng)劑P5作為治療型糖尿病的潛在藥物。這項(xiàng)技術(shù)通過(guò)血小板源生長(zhǎng)因子受體跨膜結(jié)構(gòu)域(PDCFR-TM) ,將候選肽段展示于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面,結(jié)合目標(biāo)跨膜蛋白質(zhì)的功能報(bào)告系統(tǒng)，利用流式細(xì)胞術(shù)與高通量測(cè)序篩選靶向跨膜蛋白質(zhì)的肽類激動(dòng)劑。該系統(tǒng)通過(guò)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)目標(biāo)跨膜蛋白質(zhì),而非固相化的重組蛋白質(zhì),最大程度上保持了其天然狀態(tài),并且利用報(bào)告系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基于功能的篩選。

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