摘要  G蛋白偶聯受體( G protein-coupled receptors，GPCRs )是哺乳動物體內最大的細胞膜表面受體家族,具有7次跨膜螺旋結構。人類基因組編碼約800種不同類型的GPCRs,廣泛參與了代謝性疾病及腫瘤等多種重大疾病的病理過程,使之成為藥物研發(fā)的熱門靶點。肽是介于氨基酸和蛋白質之間的一類物質,由兩個至幾十個氨基酸通過肽鍵連接而成,是涉及生物體內多種細胞功能的生物活性物質。迄今為止,研究者已鑒定出7 000余種天然肽,分別作為激素、神經遞質、生長因子、離子通道配體和抗生素等發(fā)揮功能。肽類藥物因具有作用機制明確、安全性好、生產成本低等多重獨特優(yōu)勢及其在空間結構上近乎無限的可能性而逐漸受到重視。

近年來,基于對CPCR結構的理解不斷深入,靶向GPCR的肽類藥物發(fā)展迅猛,新藥不斷上市。目前為止,美國食品和藥物管理局(FDA)已批準上市近50種靶向CPCR的肽類藥物,用于治療代謝性疾病、神經系統(tǒng)疾病和癌癥等多種疾病。肽類藥物的研發(fā)經歷了人體肽開發(fā)、天然肽開發(fā)和生物技術開發(fā)3個階段。目前,已上市的靶向GPCR肽類藥物大多是對人體天然內源性多肽類配體的改造與修飾。本文歸納了近年來研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物,并簡要總結了目前肽類藥物的研發(fā)策略及未來潛在的發(fā)展方向,旨在為更多靶向GPCR肽類藥物的研發(fā)提供參考。

作為人體內最大的細胞膜表面受體家族,G蛋白偶聯受體(G protein coupled receptors，GPCRs)參與了包括糖尿病、心血管疾病、自身免疫病、腫瘤等在內的多種重大疾病的病理過程。靶向CPCR藥物的開發(fā)一直是藥物研發(fā)的熱點,美國食品和藥物管理局(FDA)批準的全部藥物中有超過1/3都以GPCR為作用靶點。肽是介于氨基酸和蛋白質之間的一類物質,由2個至幾十個氨基酸通過肽鍵連接而成。迄今為止,已鑒定出7000余種天然肽,分別作為激素,神經遞質、生長因子,離子通道配體和抗生素等發(fā)揮功能。在人體內,肽類參與多種重要生理過程:例如胰島素( insulin)促進糖原、脂肪和蛋白質的合成代謝,發(fā)揮降血糖的作用;又如催產素( oxytocin)在分娩過程中促進子宮平滑肌的收縮,并刺激乳腺射乳反應。肽作為一類信號分子,通過結合細胞膜表面受體,例如GPCRs ,離子通道( ion channels)等,啟動特定的細胞信號轉導過程。近年來,肽類藥物逐漸引起醫(yī)藥界的重視,其憑借生物活性高、安全性好、生產成本低等特性及其在空間結構上近乎無限的可能性被視為藥物研發(fā)的新增長點。在本篇綜述中,歸納了研發(fā)成功已上市的靶向GPCR肽類藥物,并簡要總結了目前肽類藥物的研發(fā)策略和未來可能的發(fā)展方向。

1 G蛋白偶聯受體及其信號轉導通路

人類基因組編碼超過800種 GPCR,其配體可以是小分子糖類、脂質和多肽,也可以是蛋白質等生物大分子。GPCR的共同特點是其立體結構包含7個跨膜α螺旋,因此又被稱為7次跨膜受體,同時其胞內區(qū)有G蛋白(鳥苷酸結合蛋白)結合位點7。根據其結構的相似性,GPCR可被分為5類,分別是:視紫紅質樣家族( rhodopsin-like family)、分泌素受體( secretin receptors )、代謝型谷氨酸受體( metabotropic glutamate receptors)、黏附素受體( ad-hesion receplors)以及Frizzled/Taste2受體( Frizzled/'Taste2 receptors )。2012年,諾貝爾化學獎授予了美國科學家Robert J. Lefkowitz和 Brian K. Kobilka ，以表彰他們在CPCR功能及結構研究中的突出貢獻。他們的工作推動了CPCR結構生物學的大發(fā)展,新的GPCR 結構不斷被解析公布,使人們對GPCR的結構復雜性及其信號傳導的復雜性有了更深入的認識。

經典的GPCR信號轉導由C蛋白介導。G蛋白是由Ga 、Gp.Gy三個亞基組成的異源三聚體。其中 ,Gα 亞基是具有GIP酶活性的分子開關蛋白質,Gβ和Gy則以二聚體形式緊密結合。Gα有4種亞型:Go..Gx;,. .Gαg和 Gorws。每種亞型結合不同的效應器蛋白質,效應器蛋白質可以直接或通過第二信使進一步激活下游效應(見Table 1 )。

以Gα.為例:CPCR與配體結合后構象發(fā)生改變,活化的受體與G蛋白三聚體α亞基結合,導致Go亞基上的GDP與胞質中的GTP交換, Go亞基與受體和Gβy亞基解離,結合并激活腺苷酸環(huán)化酶( adenylate cyclase，AC) ,進而使細胞內環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)濃度增高，cAMP與蛋白質激酶A( protein kinase A，PKA)調節(jié)亞基結合,導致催化亞基被釋放并入核,使cAMP應答元件結合蛋白質(CREB)磷酸化,磷酸化的CREB與核內CREB結合蛋白質(CBP)特異結合形成復合物,復合物與靶基因調控序列結合,激活靶基因轉錄。分離的Gβy亞基也可以激活下游效應分子,例如磷脂酶C( phospholipase C，PLC), PLC可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸( phosphatidylinositol-4,5-bi-sphosphate，PIP,)水解成第二信使肌醇三磷酸( inositol-1 ,4 ,5-trisphosphate，IP,)和二酰甘油( di-acylglycerol，DAG)——IP。刺激細胞內質網釋放Ca進入細胞質基質,使胞內Ca*濃度升高;DAG激活蛋白質激酶C( protein kinase C，PKC) ,進而觸發(fā)MAPK(mitogen activated protein kinase)信號通路(見Fig.1)。

GPCR另一種信號轉導機制由GPCR激酶( CRKs)和抑制蛋白( arrestin)介導。GPCR與GRKs結合導致受體磷酸化,從而終止 GPCR 與G蛋白的相互作用;同時, CPCR磷酸化還啟動GPCRs與β-抑制蛋白結合。傳統(tǒng)觀點認為,β-抑制蛋白是作為GPCR信號通路的負反饋調節(jié)機制存在的。近年來發(fā)現,其也能啟動非G蛋白依賴的下游信號通路。某些配體與GPCR結合可導致受體選擇性與不同亞型的G蛋白或β-抑制蛋白相互作用,從而有偏向性地激活某些特定的信號通路,這些配體被稱為“偏向性配體”。具有偏向性的配體與受體結合可激活β-抑制蛋白通路,β-抑制蛋白可以與許多下游效應蛋白質相互作用,例如MAPK 、PKB( protein kinase B)等,在 GPCR 信號轉導過程中發(fā)揮關鍵作用。這一發(fā)現為靶向GPCR藥物的研發(fā)提供了新的方向;具有偏向性的配體能特異性地激活G蛋白或者β-抑制蛋白介導的信號通路,相比傳統(tǒng)配體其表現出更強的靶向性,這對提高藥效有重要的意義。

2 肽類藥物及其研發(fā)策略

多肽作為藥物具有許多獨特的優(yōu)勢:( 1)大量天然肽類可作為配體作用于細胞膜表面受體。據此開發(fā)的肽類藥物作用機制明確、生物活性高、用藥劑量小;(2)與小分子藥物相比,肽類藥物不通過肝的代謝,其代謝產物為氨基酸,幾乎無毒性且一般不會在特定器官組織中累積,因此副作用發(fā)生率低,安全性好;(3)與蛋白質等生物大分子相比,肽類藥物易于合成,容易與雜質或副產品分離,純度高,且其研發(fā)周期短,生產成本低,易滿足中等規(guī)模治療的需要。鑒于這些良好的藥理特性和固有優(yōu)勢,肽類藥物成為近年來新藥物研發(fā)的熱點。目前,已有50多種靶向GPCR肽類藥物被美國FDA批準,其中大多數用于代謝性疾病或腫瘤的治療,肽類藥物的研發(fā)經歷了人體肽開發(fā)、天然肽開發(fā)和生物技術開發(fā)3個階段。最初的關注點集中于對人體肽類激素的開發(fā)和利用。目前,上市的藥物大多都是用這個策略合成的,最為典型的例子是胰島素。上世紀80 ~90年代,研究者利用重組DNA技術制造出高純度的生物合成人胰島素,并通過對肽鏈進行修飾合成了胰島素類似物,實現了速效和長效。上世紀末,研究人員將探索范圍擴大到存在于微生物、植物、動物毒液中的天然肽類。例如，用于2型糖尿病及肥胖癥治療的Exendin-4。繼對天然肽類的大規(guī)模挖掘之后,肽類藥物的研發(fā)走上了利用分子生物學技術進行篩選和開發(fā)的必由之路。

利用分子生物學技術開發(fā)肽類藥物的兩大基礎是高豐度肽庫的建立和合適的篩選策略。1985年，George P Smith通過將肽段融人噬菌體表面蛋白質，開發(fā)出了噬菌體展示技術( phage display)。1990年,George P Smith 與 Jamie K Scott將隨機序列肽展示在噬菌體表面,建立了噬菌體展示隨機肽庫。噬菌體展示技術通過多輪親和篩選,可在高豐度隨機肽庫(豐度可達10°)中篩選出與靶蛋白質具有高親和力的肽段,通過 DNA測序確定候選肽的編碼信息,從而將肽段與靶蛋白質的親和力屬性( pheno-type ，affinity )與肽段遺傳信息( genotype，DNA se-quence)相關聯。隨后,新的mRNA展示技術、核糖體展示技術和酵母展示技術等不斷涌現,它們與噬菌體展示技術一起在過去20年中不斷得到發(fā)展與優(yōu)化,理論上能夠針對任何靶蛋白質進行基于親和力的高通量篩選。

2014年,美國Scripps研究所Lerner課題組利用一種哺乳動物細胞系中的自分泌信號系統(tǒng)( auto-crine-based signaling system) ,成功篩選出GLP-1R的新型肽類激動劑P5作為治療型糖尿病的潛在藥物。這項技術通過血小板源生長因子受體跨膜結構域(PDCFR-TM) ,將候選肽段展示于哺乳動物細胞表面,結合目標跨膜蛋白質的功能報告系統(tǒng)，利用流式細胞術與高通量測序篩選靶向跨膜蛋白質的肽類激動劑。該系統(tǒng)通過在哺乳動物細胞中過表達目標跨膜蛋白質,而非固相化的重組蛋白質,最大程度上保持了其天然狀態(tài),并且利用報告系統(tǒng)實現了基于功能的篩選。

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