2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 淋洗液的選擇

以 SH–AC–3 型陰離子交換柱為分離柱，以 Na2CO3–NaHCO3 溶液為淋洗液，取模擬尿樣進(jìn)行測 定，考察淋洗液對各組分的分離效果。當(dāng) Na2CO3– NaHCO3 淋洗液的濃度配比在 6∶1～6∶3 mmol／L 時(shí)，均可將草酸和硫氰酸鹽與尿液中的氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子完全分離，各組分相對于 后續(xù)組分的分離度（R）不小于 1.5，但硫氰酸鹽的保 留時(shí)間（t）超過 24 min，分析效率低下。為縮短硫氰酸鹽的保留時(shí)間，提高分析工作效率，以洗脫能 力較強(qiáng)的 Na2CO3 溶液進(jìn)行了淋洗試驗(yàn)，設(shè)置流量 為 1.0 mL／min，試驗(yàn)結(jié)果列于表 1。由表 1 可知， 當(dāng) Na2CO3 溶液濃度分別為 8.0、10.0、12.0 mmol／L 時(shí)，草酸和硫氰酸鹽與尿液中的氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽（當(dāng) Na2CO3 溶液超過 8 mmol／L 時(shí)磷酸鹽 和硫酸鹽合并為一個(gè)色譜峰）等陰離子均可完全分 離，且硫氰酸鹽的保留時(shí)間分別縮短至 21、20 和 19 min 左右?？紤]到 Na2CO3 溶液濃度增大，相應(yīng)的 抑制電流也高，不利于抑制器的使用，為保證適 宜的分離度和較短的保留時(shí)間，選擇 10.0 mmol／L Na2CO3 溶液為淋洗液。

表 1 Na2CO3 溶液濃度對分離結(jié)果的影響

2.1.2 色譜柱的選擇

以 10.0 mmol／L Na2CO3 溶液為淋洗液，流量 為 1.0 mL／min 進(jìn)行等度洗脫，取模擬尿樣進(jìn)行測 定，考察了青島盛瀚色譜公司生產(chǎn)的 SH–AC–1 型 和 SH–AC–3 型陰離子交換柱對草酸和硫氰酸鹽與 氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子的分離情況。 結(jié)果表明，在此條件下 SH–AC–1 型柱雖能將草酸 與常見陰離子完全分離，但硫氰酸鹽在 90 min 內(nèi)尚 未出峰；而 SH–AC–3 型柱不但可將草酸和硫氰酸 鹽與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子完全分 離，且硫氰酸鹽的保留時(shí)間小于 21 min。故本實(shí)驗(yàn) 選擇 SH–AC–3 型陰離子交換柱為分離柱。

2.1.3 淋洗液流量的選擇

淋洗液濃度相同，流量不同時(shí)，組分的分離 度和保留時(shí)間會(huì)發(fā)生改變?？疾?10.0 mmol／L Na2CO3 為淋洗液，不同流量時(shí)草酸和硫氰酸鹽與 氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等陰離子的分離效果，試 驗(yàn)結(jié)果列于表 2。由表 2 可知，當(dāng)淋洗液流量從 0.8 mL／min 增加至 1.2 mL／min 時(shí)，氯化物、磷酸鹽和 硫酸鹽、草酸和硫氰酸鹽的保留時(shí)間逐漸變短，分 離度逐漸下降，但氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽、草酸的 分離度遠(yuǎn)大于 1.5 達(dá)到完全分離的標(biāo)準(zhǔn)。在保證待 測組分與干擾離子完全分離的前提下盡量使用較 低的流量，以減少系統(tǒng)壓力，因此淋洗液流量選定 為 1.0 mL／min。

表 2 不同 Na2CO3 淋洗液流量試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 柱箱溫度的確定

考察了柱溫分別在 30、35、40 ℃時(shí)各組分的分 離效果，結(jié)果顯示，在所選溫度下，草酸和硫氰酸鹽 均能與氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等常見陰離子完全 的分離，且隨著柱溫的升高組分的保留時(shí)間稍微縮 短，分離度逐漸下降，草酸的色譜峰面積隨著柱溫的 升高而增長，從 30 ℃上升 35 ℃，增長 10% 左右，從 35 ℃上升 40 ℃，增長 6% 左右；硫氰酸鹽的色譜峰 面積隨著柱溫的升高基本保持不變。在保證適宜的 保留時(shí)間和較高的分離度的情況下，盡量采用較低 的柱溫，本試驗(yàn)確定柱箱溫度為 35 ℃，這也是色譜 柱使用說明書推薦的使用溫度。

2.2 線性關(guān)系與檢出限

按照 1.2 配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，測定各 管的色譜峰面積，以色譜峰面積（S）為縱坐標(biāo)，以各 組分的質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行 線性回歸。 測定儀器 30 min 的基線噪聲，以 3 倍基線噪聲 除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（3N／b）計(jì)算草酸和硫氰酸鹽 的檢出限。 其線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（回歸曲線的 截距、斜率和相關(guān)系數(shù)由儀器軟件給出）、檢出限列。草酸和硫氰酸鹽的質(zhì)量濃度在0.20～30.0 mg／L范圍內(nèi)與色譜峰面積線性良好，線性相關(guān)系數(shù)分別為 0.999 29、0.999 49，檢出限分別為 0.04、0.03 mg／L。

2.3　共存陰離子及抗壞血酸的影響

由于尿液中含有大量的有機(jī)物和氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽等陰離子，尿樣通過 C18 柱的凈化可以消除有機(jī)物的影響，尿液經(jīng) 10 倍稀釋以降低氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽的影響?？疾炝寺然锏?3 種陰離子對草酸和硫氰酸鹽測定結(jié)果的影響，結(jié)果表明，氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽的保留時(shí)間遠(yuǎn)小于草酸和硫氰酸鹽的保留時(shí)間，且 500 mg／L Cl–、300 mg／L H2PO4–、SO42–（H2PO4–、SO42– 完全分不開合并為一個(gè)峰）不影響 50 mg／L 的草酸、3 mg／L 的硫氰酸鹽的測定，分離色譜圖見圖 1。

圖 1　常見陰離子與草酸和硫氰酸鹽分離色譜圖

尿液中可能含有抗壞血酸，在堿性條件下，抗血酸易發(fā)生降解反應(yīng)，而草酸是抗壞血酸的降解產(chǎn)物之一，可能會(huì)影響草酸的準(zhǔn)確測定，有研究顯示在 15.0 mmol／L NaHCO3 溶液 (pH=8.3) 中 40 mg／L 的抗壞血酸在 80 min 內(nèi)未降解為草酸，本試驗(yàn)使用 10.0 mmol／L Na2CO3 溶液（pH ≈ 11.1）為淋洗液，pH 值遠(yuǎn)大于 8.3，樣品從進(jìn)樣到草酸出峰超過 11 min，這段時(shí)間尿液中的抗壞血酸可能降解生成草酸而影響測定。觀察用純水配制 30 mg／L的抗壞血酸的降解情況，結(jié)果表明本試驗(yàn)條件下 30 mg／L 的抗壞血酸降解產(chǎn)生約 0.3 mg／L 的草酸。試驗(yàn)采用亞硫酸鹽（SO32–）抑制抗壞血酸的降解，這在易氧化藥物制劑中加入亞硫酸鹽以提高藥物穩(wěn)定性的方法原理相似。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，50 mg／L 的 SO32– 可抑制 30 mg／L 抗壞血酸的降解，且至少在 120 min 內(nèi) 30 mg／L 抗壞血酸對 10.0 mg／L 的草酸的色譜峰面積與峰高無明顯影響（增加值 <5%）。同時(shí) 50 mg／ L 的 SO32– 對草酸和硫氰酸鹽的測定結(jié)果無明顯影響（誤差 <5%）。

2.4　加標(biāo)回收試驗(yàn)

取 3 份 1.5 mL 樣液于樣品瓶中，按 1.6 步驟操作，測得草酸和硫氰酸鹽的含量。在 3 份尿樣中分別添加 2.0、5.0、10.0 mg／L 的草酸和硫氰酸鹽，平行測定 5 次，并計(jì)算草酸和硫氰酸鹽的回收率及測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表 3。由表 3 可知，3 份尿液草酸和硫氰酸鹽的測定結(jié)果分別為 4.71～14.83 mg／L 和 0.21～0.72 mg／L，加標(biāo)回收率分別為 95.0%～101.1% 和 95.5%～100.5%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 1.34%~2.06% 和1.56%~2.91%。

表 3　加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果樣品

3　結(jié)語

本文呢建立了抑制電導(dǎo)檢測 – 離子色譜法同時(shí)測定尿液中草酸和硫氰酸鹽的分析方法。該方法具有 良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，操作簡便快速，尿樣通過 C18 柱的凈化可以消除有機(jī)物的影響，尿液稀釋 10 倍后可降低氯化物、磷酸鹽和硫酸鹽的影響。該方 法以自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，降低檢驗(yàn)人員的工作強(qiáng)度， 提高了工作效率，適用尿液中草酸和硫氰酸鹽的同時(shí)測定。

相關(guān)鏈接：磷酸鹽，硫酸鹽，色譜峰，抗壞血酸，抑制，氯化物，有機(jī)物，北納生物

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