17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是一種能夠促進(jìn)動(dòng)物生長、提高奶牛產(chǎn)奶量的甾體雌激素，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，即使低濃度的E2殘留物通過食物鏈進(jìn)入生物體，也會干擾正常的內(nèi)分泌功能，造成有害影響。碳量子點(diǎn)（CQDs）作為一種新興熒光碳納米材料，已被廣泛用于構(gòu)建熒光傳感器對環(huán)境和食品中的有害物質(zhì)進(jìn)行檢測。熒光猝滅劑金納米粒子（AuNPs）憑借其易于控制的粒徑大小、良好的生物相容性和優(yōu)異的熒光猝滅能力而廣泛用于光學(xué)和生物傳感器之中。

近日，華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院將CQDs與AuNPs結(jié)合，利用FRET效應(yīng)構(gòu)建一種熒光適體傳感器用于E2的檢測。首先通過酰胺反應(yīng)將E2的短鏈適配體P1連接在CQDs上，AuNPs加入后適配體會與AuNPs靠近，從而觸發(fā)CQDs與AuNPs間的FRET效應(yīng)，導(dǎo)致CQDs的熒光猝滅。當(dāng)加入目標(biāo)物E2后，適配體P1與E2間更強(qiáng)烈的親和力使P1從AuNPs表面脫離，CQDs的熒光得以恢復(fù)，并以此建立熒光恢復(fù)強(qiáng)度與E2濃度的線性關(guān)系，達(dá)到定量檢測E2的目的。此外該熒光短鏈適體傳感器對牛奶和環(huán)境水樣中的E2進(jìn)行檢測，其結(jié)果與HPLC方法結(jié)果一致，以證明該傳感器在實(shí)際應(yīng)用中的潛力。

1 基于AuNPs的熒光適體傳感器檢測E2的原理

AuNPs是一種消光系數(shù)高、具有拉曼增強(qiáng)特性且尺寸容易控制的金屬納米材料，還是一種優(yōu)良的熒光猝滅劑，在光學(xué)傳感中有著出色的表現(xiàn)。因此本實(shí)驗(yàn)利用AuNPs的熒光猝滅作用建立了一種靈敏、準(zhǔn)確、快捷的熒光適體傳感器。首先利用酰胺反應(yīng)在CQDs上連接E2的短鏈適配體P1，形成CQDs-P1，然后通過檸檬酸鹽還原法合成了酒紅色的AuNPs，當(dāng)在離心管中加入這二者時(shí)，由于適配體堿基間的金屬配位作用，AuNPs對適配體具有較強(qiáng)的吸附親和力，CQDs-P1會吸附在AuNPs表面，而CQDs的熒光發(fā)射光譜與AuNPs的紫外吸收光譜有較大的重疊，當(dāng)它們相互靠近時(shí)且CQDs與AuNPs的距離在10 nm以內(nèi)時(shí)，處于激發(fā)態(tài)的CQDs就會將能量轉(zhuǎn)移至處于基態(tài)的猝滅劑AuNPs，即FERT效應(yīng)，表現(xiàn)為CQDs的熒光被猝滅；當(dāng)目標(biāo)物E2加入溶液體系后，適配體P1更傾向于與E2結(jié)合從而離開AuNPs表面，缺乏近距離這一條件后FRET不再發(fā)生，CQDs的熒光得以恢復(fù)，因此可以通過建立E2濃度與熒光恢復(fù)程度的線性關(guān)系達(dá)到定量檢測E2的目的。

2 CQDs的表征

通過微波輔助水熱法快速合成熒光CQDs，其形貌特征通過透射電子顯微鏡圖像進(jìn)行觀察。CQDs外觀接近球形并且在溶液中分散均勻，其粒徑在2.0～6.0 nm之間，平均值在3.5 nm左右?？梢杂^察到CQDs的最佳熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長分別位于350 nm和442 nm，并且由于芳香族C＝C鍵的π-π*躍遷和C＝O鍵的n-π*躍遷，CQDs的UV-Vis光譜在239 nm和346 nm處分別有一個(gè)吸收峰。右上角的插圖顯示了合成的CQDs在自然光下呈現(xiàn)淺黃色（左），在365 nm的紫外燈照射下會發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光（右），表明制備的CQDs具有良好的熒光性能。此外，利用FTIR光譜對CQDs表面的官能團(tuán)進(jìn)行研究，很明顯在3250 cm-1附近出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)寬峰，這歸因于O—H和N—H的伸縮振動(dòng)，另外在1 683 cm-1和1257 cm-1觀察到的兩個(gè)吸收峰分別是由C—O和C—N的伸縮振動(dòng)引起，在1544 cm-1和1378 cm-1出現(xiàn)的吸收峰分別是N—H和—CH2的變形振動(dòng)導(dǎo)致，最后在1186、1072 cm-1和992 cm-1處觀察到的弱吸收峰是由C—OH的伸縮振動(dòng)引起。

3 CQDs-P1的表征

通過UV-Vis光譜表征E2短鏈適配體P1在CQDs上的連接，單獨(dú)的P1由于其堿基在260 nm觀察到明顯的紫外吸收峰，單獨(dú)的CQDs在346 nm和249 nm兩個(gè)位置出現(xiàn)了紫外吸收峰，而連接了P1的CQDs同時(shí)在346 nm和260 nm左右出現(xiàn)了歸屬于P1和CQDs的紫外吸收峰，初步證明了CQDs-P1的形成。泳道1是CQDs，在紫外燈的照射下觀察不到DNA條帶的存在，泳道2是適配體P1，可以看見清晰明亮的DNA條帶出現(xiàn)，泳道3代表與CQDs反應(yīng)后的P1，由于連接了CQDs，P1的遷移率降低，導(dǎo)致其條帶明顯落后泳道2，其下方的另外一條條帶應(yīng)該是多余的未連接的P1，該結(jié)果更為有力地證明了CQDs-P1的成功合成。

4 AuNPs的表征

加入700?μL檸檬酸鹽還原出的AuNPs呈現(xiàn)近圓形，粒徑在30～40 nm范圍內(nèi)，與理論計(jì)算值相近，但大小均勻性不是很好，這可能是一步還原法的不足之處。實(shí)驗(yàn)中展示了所合成的AuNPs在527 nm處由于Au的表面等離子體共振所引起的寬紫外吸收帶，可以觀察到它和CQDs的熒光發(fā)射光譜有較大面積的重合，符合FRET發(fā)生的條件之一，右上角的插圖是AuNPs的圖片，可以看到AuNPs在自然光下呈現(xiàn)粉紫色，以上結(jié)果證明了AuNPs的成功合成和AuNPs作為優(yōu)良熒光猝滅劑的潛力。

5 E2檢測的可行性分析及檢測條件優(yōu)化

5.1 可行性分析

CQDs-P1表示100?μL?CQDs-P1與400?μL?PB混合均勻后測試得到的熒光光譜，其熒光強(qiáng)度最高；CQDs-P1＋AuNPs表示200?μL?AuNPs與200?μL?PB加入到100?μLCQDs-P1溶液中，然后輕柔振蕩20 min后測試得到的熒光光譜，可以看出其熒光強(qiáng)度明顯降低，證明CQDs的熒光確實(shí)能被AuNPs有效猝滅；CQDs-P1＋AuNPs＋E2則表示200μL AuNPs與100?μL?PB加入到100?μL?CQDs-P1溶液中輕柔振蕩20 min，再加入100?μL?10-6 mol/L E2孵育60 min后測試得到的熒光光譜，相較于被猝滅的熒光強(qiáng)度，能觀察到加入E2后其熒光有明顯的恢復(fù)，證明E2與其適配體結(jié)合并將其帶離了AuNPs表面，使得CQDs熒光恢復(fù)。由此可知，將該熒光適體傳感器用于E2的檢測可行。

5.2 AuNPs粒徑優(yōu)化

隨著Tc溶液添加量從500?μL增加到900?μL，還原得到的AuNPs其表面等離子體共振峰位置從531 nm逐漸藍(lán)移至522 nm，通過紫外峰位置與AuNPs粒徑的關(guān)系換算得知其粒徑分別為50、42、39、32、15 nm，右上角的插圖顯示了隨著粒徑的減?。═c溶液添加量的增加），AuNPs溶液的顏色逐漸由紫紅色轉(zhuǎn)變成亮酒紅色。隨后將合成的不同粒徑的AuNPs溶液用于猝滅CQDs的熒光，在AuNPs加入體積固定為100?μL的前提下，不同粒徑的AuNPs對CODs熒光的猝滅效率相差不大，都能猝滅CQDs 30%左右的熒光，39 nm的AuNPs表現(xiàn)出最佳的熒光猝滅效率，可能是因?yàn)檫@個(gè)粒徑大小的AuNPs在溶液中比較穩(wěn)定，并且適合吸附大量的CQDs-P1，因此AuNPs的粒徑優(yōu)化為39 nm。根據(jù)紫外吸光度與該粒徑大小的AuNP濃度關(guān)系換算得到，合成并濃縮5倍后39 nm的AuNP濃度大約為 4.57×10-10 mol/L。

5.3 AuNPs添加體積和猝滅時(shí)間優(yōu)化

在AuNPs粒徑優(yōu)化為39 nm的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對AuNPs的添加體積和猝滅時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。在CQDs-P1的溶液中分別加入100、150、200、250、300?μL的AuNPs溶液進(jìn)行熒光猝滅實(shí)驗(yàn)，隨著AuNPs溶液的添加體積從100?μL增加到200?μL，CQDs的熒光猝滅程度逐漸增加，而當(dāng)AuNPs溶液的添加體積進(jìn)一步增加時(shí)，CQDs的熒光猝滅程度卻在逐漸降低，這可能是因?yàn)槿芤后w系中AuNPs濃度較大，容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致AuNPs沉降，進(jìn)而影響到其對CQDs熒光的猝滅，因此AuNPs的添加體積優(yōu)選為200?μL。200?μL濃度約為4.57×10-10 mol/L的AuNPs加入到CQDs-P1溶液中不同時(shí)間后對CQDs熒光的猝滅效率，可以看到隨著時(shí)間的延長，AuNPs對CQDs熒光的猝滅效率越來越高，說明越來越多的CQDs-P1吸附到AuNPs上，熒光猝滅效率在20 min之后達(dá)到平穩(wěn)，此時(shí)應(yīng)該已經(jīng)達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，因此AuNPs對CQDs的猝滅時(shí)間優(yōu)化為20 min。

5.4 E2與P1孵育時(shí)間優(yōu)化

E2與CQDs-P1/AuNPs溶液體系分別孵育15、30、45、60、75、90 min后的相對熒光強(qiáng)度（F－F0，F(xiàn)0為CQDs熒光被AuNPs猝滅后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為猝滅后再加入E2的熒光強(qiáng)度），即熒光的恢復(fù)程度，隨著孵育時(shí)間的延長，體系的F－F0越來越高，表明越來越多的P1與E2結(jié)合并不再吸附在AuNPs表面，從而引起CQDs熒光的恢復(fù)，體系的F－F0在60 min后趨于穩(wěn)定，表明此時(shí)E2能結(jié)合的P1達(dá)到了最大值。因此熒光的恢復(fù)時(shí)間優(yōu)化為60 min。

6 熒光適體傳感器檢測E2的靈敏度測試

CQDs-P1溶液具有最高的熒光強(qiáng)度，加入AuNPs后其熒光被大幅度猝滅（F0），隨著加入E2濃度的增大，CQDs的熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)的越來越高（F），可以觀察到E2最終濃度低至2×10-10 mol/L時(shí)幾乎就起不到恢復(fù)CQDs熒光的作用了。以E2最終濃度（2×10-9～2×10-5 mol/L）的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的相對熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性方程y=58.50x＋558.95，決定系數(shù)R2為0.992。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算出該熒光適體傳感器測定E2的LOD為3.4×10-10mol/L，LOQ為1.0×10-9mol/L。結(jié)果表明，該傳感器對痕量E2的定量檢測具有寬廣的檢測范圍和較高的靈敏度。

7 熒光適體傳感器檢測E2的特異性及重復(fù)性測試

可以看出CQDs熒光被AuNPs猝滅后，只有加入E2或者將E2連同干擾物一起加入才能引起熒光大幅度的恢復(fù)，而單獨(dú)加入上述干擾物質(zhì)幾乎不會引起熒光強(qiáng)度的變化，表明適配體只會特異性地與E2結(jié)合從而恢復(fù)CQDs的熒光，該結(jié)果證明了所構(gòu)建的熒光適體傳感器在檢測E2時(shí)具有良好的選擇性。另一方面，為了研究該熒光適體傳感器用于E2檢測的重復(fù)性，制備了10組E2最終濃度為2×10-7 mol/L的平行樣品用于實(shí)驗(yàn)，可以看出這10組平行樣品的熒光恢復(fù)程度接近，計(jì)算其F－F0的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.0%，說明該熒光適體傳感器對E2 的檢測同樣具有良好的重復(fù)性。

8 實(shí)際樣品中E2的檢測

該研究選擇牛奶、湖水和實(shí)驗(yàn)室自來水作為實(shí)際樣品對E2進(jìn)行加標(biāo)檢測，將其按照1.3.6節(jié)經(jīng)過簡單的預(yù)處理后制備成E2的加標(biāo)溶液，然后與CQDs-P1和AuNPs的混合溶液孵育60 min后進(jìn)行熒光測試，其中E2的加標(biāo)終質(zhì)量濃度為1、2.5、5?μg/mL。另外也對未添加E2的牛奶和水樣進(jìn)行了檢測，將其作為對照結(jié)果。顯示在對照中未檢測到E2的存在，原因可能是所選取的牛奶和水樣中E2的濃度低于該適體傳感器的檢出限；此外，不同E2加標(biāo)質(zhì)量濃度的牛奶樣品獲得的回收率為89.67%～108.66%；HPLC方法檢測實(shí)際樣品中的E2得到的回收率在81.53%～115.44%之間，RSD為0.6%～9.4%。從結(jié)果可以得出該熒光適體傳感器的檢測結(jié)果與HPLC方法得到的檢測結(jié)果較為一致，表明該熒光適體傳感器在監(jiān)測實(shí)際樣品中E2的含量時(shí)具有良好的準(zhǔn)確度和精度，并且有望作為一種簡便快捷的傳感方法在現(xiàn)實(shí)場景中準(zhǔn)確靈敏地檢測痕量的E2殘留。

9 結(jié) 語

利用AuNPs對CQDs熒光的猝滅作用建立了一種用于E2檢測的熒光適體傳感器，結(jié)果顯示該傳感器對E2具有寬廣的檢測范圍（2×10-5～2×10-9mol/L），且LOD能達(dá)到3.4×10-10 mol/L，E2和其短鏈適配體的高親和性賦予了該傳感器良好的選擇性，最后將其用于牛奶和湖水等實(shí)際樣品中E2的檢測，得到的回收率為89.67%～113.36%，RSD為1.4%～6.3%，其結(jié)果與HPLC方法檢測E2得到的結(jié)果較為一致，表明該傳感器具有實(shí)際的應(yīng)用潛力。

相關(guān)鏈接：17β-雌二醇，甾體雌激素，檸檬酸鹽，酰胺，傳感器，北納生物

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