近日，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院以D-gal皮下注射建立小鼠衰老模型，利用超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（UPLC-QE-MS）代謝組學(xué)技術(shù)，并采用偏最小二乘判別分析（PLSDA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）方法結(jié)合變量投影重要度（VIP）與非參數(shù)檢驗(yàn)共同分析對(duì)照組、D-gal衰老模型組、普洱熟茶組小鼠腦組織和血清中代謝物的變化規(guī)律，通過(guò)總體（腦組織）及外周（血清）代謝組學(xué)探尋普洱熟茶延緩衰老的潛在代謝物，揭示與普洱熟茶抗衰老作用機(jī)制有關(guān)的代謝通路，以期為普洱熟茶的作用機(jī)制研究提供新的思路。

普洱熟茶是一種以云南大葉種曬青毛茶經(jīng)微生物發(fā)酵加工而成的后發(fā)酵茶，可作為一種長(zhǎng)期飲用的飲品。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，普洱熟茶可以有效提高D-半乳糖（D-gal）致衰老小鼠肝臟中超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，降低丙二醛含量，表明普洱熟茶能夠?qū)棺杂苫鶕p害，有效預(yù)防由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷，具有強(qiáng)抗氧化能力，從而延緩衰老。

1 普洱熟茶對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在5 d定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠逃避潛伏期均縮短。與第1天相比，第5天對(duì)照組、D-gal模型組、普洱熟茶組小鼠逃避潛伏期分別縮短58.42%、50.54%、32.57%。

由實(shí)驗(yàn)可知，在第6天空間探索實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，D-gal模型組小鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）；與D-gal模型組相比，普洱熟茶組小鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間顯著縮短18.12%（P＜0.05）。結(jié)果表明機(jī)體的衰老會(huì)引起小鼠學(xué)習(xí)記憶能力衰退，給予普洱熟茶能夠提高衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2 普洱熟茶對(duì)衰老小鼠腦組織代謝物變化的影響

采用PLS-DA法將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的3 組小鼠樣本的UPLC-QE-MS腦組織代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行整體分析，結(jié)果表明3 組樣本能夠被明顯區(qū)分，說(shuō)明注射D-gal的衰老小鼠和給予普洱熟茶的衰老小鼠腦內(nèi)代謝物發(fā)生顯著變化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證3 組樣本的分離，并篩選關(guān)鍵代謝物，進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果表明對(duì)照組和D-gal模型組、D-gal模型組和普洱熟茶組樣本顯著分離，數(shù)據(jù)模型有較好的擬合度及預(yù)測(cè)能力。其中對(duì)照組和D-gal模型組RX2＝0.679，RY2＝0.992，Q2＝0.829；D-gal模型組和普洱熟茶組RX2＝0.631，RY2＝0.968，Q2＝0.681。通過(guò)置換檢驗(yàn)進(jìn)行模型驗(yàn)證，200 次置換檢驗(yàn)后對(duì)照組和D-gal模型組的截距R2＝0.826，Q2＝－0.597，D-gal模型組和普洱熟茶組的截距R2＝0.924，Q2＝－0.340，表明模型有較好的預(yù)測(cè)能力與可靠性。

為了進(jìn)一步分析普洱熟茶延緩小鼠衰老的相關(guān)差異代謝物，根據(jù)VIP＞1、P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)KEGG在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選鑒定出26 種差異代謝物，主要分為甘油磷脂類(lèi)、氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酰類(lèi)、核苷等。與D-gal模型組相比，普洱熟茶組中18 種代謝物表達(dá)上調(diào)，8 種代謝物表達(dá)下調(diào)。

3 普洱熟茶對(duì)衰老小鼠血清代謝物變化的影響

采用PLS-DA法將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的3 組小鼠樣本的UPLC-QE-MS血清代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行整體分析，結(jié)果表明3 組樣本能夠被明顯區(qū)分，說(shuō)明注射D-gal的衰老小鼠和給予普洱熟茶的衰老小鼠血清代謝物發(fā)生顯著變化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證3 組樣本的分離情況，并篩選關(guān)鍵代謝物，進(jìn)行了OPLS-DA分析，結(jié)果表明對(duì)照組和D-gal模型組、D-gal模型組和普洱熟茶組樣本顯著分離，數(shù)據(jù)模型有較好的擬合度及預(yù)測(cè)能力。其中對(duì)照組和D-gal模型組：RX2＝0.650，RY2＝0.901，Q2＝0.220；D-gal模型組和普洱熟茶組：RX2＝0.583，RY2＝0.980，Q2＝0.735。通過(guò)置換檢驗(yàn)進(jìn)行模型驗(yàn)證，200 次置換檢驗(yàn)后對(duì)照組和D-gal模型組的截距R2＝0.897，Q2＝－0.370，D-gal模型組和普洱熟茶組的截距R2＝0.881，Q2＝－0.568，表明模型有較好的預(yù)測(cè)能力與可靠性。

為了進(jìn)一步分析普洱熟茶延緩小鼠衰老的相關(guān)差異代謝物，根據(jù)VIP＞1、P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)KEGG在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選鑒定出11 種差異代謝物，主要分氨基酸、有機(jī)雜環(huán)化合物、脂肪酸類(lèi)、植物激素等。與D-gal模型組相比，普洱熟茶組中6 種代謝物表達(dá)上調(diào)，5 種代謝物表達(dá)下調(diào)。

4 差異代謝物的聚類(lèi)分析

篩選得到的差異代謝物通過(guò)層次聚類(lèi)分析能夠更直觀(guān)地顯示樣本之間的關(guān)系以及代謝物在不同樣本中表達(dá)模式上的差異。根據(jù)上方樣本聚類(lèi)的樹(shù)狀圖，小鼠腦組織樣本可分成兩個(gè)區(qū)域，D-gal模型組的6 個(gè)平行樣本為第一區(qū)域，普洱熟茶組和對(duì)照組為第二區(qū)域，D-gal模型組的代謝物顏色比其他兩組深；第二區(qū)域兩組樣本分支離得越近，說(shuō)明這兩個(gè)樣本所有代謝物的表達(dá)量變化趨勢(shì)越接近。小鼠血清樣本中代謝物能夠明顯區(qū)分為D-gal模型組和其他兩組，但普洱熟茶組和對(duì)照組樣本代謝物的表達(dá)模式極接近，未完全區(qū)分。硫酸膽固醇能夠通過(guò)減少氧化應(yīng)激來(lái)調(diào)節(jié)腦代謝。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，D-gal模型組小鼠腦內(nèi)硫酸膽固醇、二磷酸腺苷核糖等代謝物表達(dá)明顯下調(diào)，表明小鼠處于氧化損傷狀態(tài)。

肌肽已被證明具有神經(jīng)保護(hù)作用，其可穿透血腦屏障，降低與多種病理狀況有關(guān)的氧化應(yīng)激。脂類(lèi)物質(zhì)與體內(nèi)自由基的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、老化速度等密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，給予普洱熟茶干預(yù)后，組氨酸代謝通路相關(guān)代謝物肌肽以及PC（15:0/15:0）、PE（22:2/14:0）等甘油磷脂代謝通路相關(guān)代謝物表達(dá)明顯升高，提高了衰老小鼠的抗氧化應(yīng)激能力。D-gal模型組小鼠體內(nèi)前列腺素D2、5’-磷酸吡哆醛代謝物表達(dá)明顯下調(diào)，給予普洱熟茶干預(yù)后其表達(dá)明顯上調(diào)，表明花生四烯酸代謝通路和VB6代謝通路被顯著激活。

5 差異代謝物的代謝通路分析

本研究結(jié)果表明普洱熟茶的干預(yù)可顯著改善小鼠學(xué)習(xí)記憶減退。本研究基于UPLC-QE-MS代謝組學(xué)方法，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析研究D-gal致衰老小鼠在普洱熟茶干預(yù)下的腦組織和血清代謝變化，鑒定分析出37 種差異代謝產(chǎn)物。通過(guò)差異代謝物和代謝通路相關(guān)性分析，篩選出4 條腦組織代謝通路，甘油磷脂代謝和組氨酸代謝通路為最顯著的關(guān)鍵代謝通路，映射出肌肽、PC（20:5/20:4）、PC（22:5/P-18:1）、PS（20:5/18:1）等10 個(gè)關(guān)鍵代謝物；篩選出2 條血清代謝通路，VB6代謝通路為最顯著的關(guān)鍵代謝通路，映射出前列腺素D2和5’-磷酸吡哆醛2 個(gè)關(guān)鍵代謝物。這些代謝物可能為延緩衰老的潛在生物標(biāo)志物。

未來(lái)可進(jìn)行代謝物在體驗(yàn)證，進(jìn)一步解析其在延緩衰老過(guò)程中的重要作用。將篩選出的差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，小鼠腦組織中篩選到甘油磷脂代謝、VB6代謝、組氨酸代謝和嘌呤代謝通路，其中甘油磷脂代謝和組氨酸代謝通路最為顯著。小鼠血清中篩選到VB6代謝和花生四烯酸代謝通路，其中VB6代謝通路最為顯著。為了更直觀(guān)地了解代謝通路映射出的12 個(gè)關(guān)鍵代謝物，采用箱形圖比較3 組間這12 種物質(zhì)的含量豐度差異。結(jié)果顯示普洱熟茶能夠延緩小鼠衰老，與D-gal組相比，其腦組織中伴隨著組氨酸代謝通路相關(guān)代謝物肌肽，VB6代謝通路相關(guān)代謝物吡哆醛，甘油磷脂代謝通路相關(guān)代謝物PC（20:5/20:4）、PC（22:5/P-18:1）、LysoPC（P-18:1）、PE（22:2/14:0）、LysoPC（18:2）、PS（20:5/18:1）、PC（15:0/15:0）以及嘌呤代謝通路相關(guān)代謝物二磷酸腺苷核糖表達(dá)量的顯著上調(diào)；血清中伴隨著花生四烯酸代謝通路相關(guān)代謝物前列腺素D2以及VB6代謝通路相關(guān)代謝物5’-磷酸吡哆醛表達(dá)量的顯著上調(diào)。

相關(guān)鏈接：D-半乳糖，丙二醛，谷胱甘肽，氨基酸，有機(jī)酸，膽固醇，北納生物

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