測序作為一種重要的實驗技術，在生物學研究中有著廣泛的應用。隨著科學的發(fā)展，傳統(tǒng)的 Sanger 測序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要，對模式生物進行基因組重測序以及對一些非模式生物的基因組測序，都需要費用更低、通量更高、速度更快的測序技術，而高通量測序技術（High-throughput sequencing）的產(chǎn)生則是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變。 二代、三代測序（NGS）的文庫制備，對測序結果的影響很關鍵，而文庫質(zhì)量的好壞除建庫方法和過程細節(jié)外，最重要的就是初始樣本的質(zhì)量。如何準確評估分離的核酸樣品是否具有足夠高的質(zhì)量？ 我們將通過以下案例為大家詳述。 核酸質(zhì)量評分：DNA 通過計算基因組質(zhì)量評分（DQN），可以高效地評估gDNA的質(zhì)量。由 Qsep 開發(fā)用于片段分析儀，數(shù)據(jù)分析軟件評估每個樣品與用戶定義的特定應用閾值用于「高質(zhì)量的 DNA」，并指定 0 到 10 之間的 DQN 值。數(shù)值反映高于定義的閾值的 DNA 的百分比。 不同 DQN 評分的基因組樣本 核酸質(zhì)量評分：RNA 有兩個指標可用于評估 RNA 的質(zhì)量。 軟件計算RNA質(zhì)量數(shù)（RQN），相當于RNA完整性數(shù)（RIN），RIN是廣泛接受的總 RNA 完整性和質(zhì)量指標。與RIN值類似，RQN 值范圍為 1 到 10， 是基于專有的計算算法，考慮 RNA 電泳圖譜的整個分布。 圖 2 不同 RQN 評分的 RNA 樣品 盡管 RIN / RQN 值是從新鮮組織分離的RNA的質(zhì)量的可靠評價標準，但它們并不是降解福爾馬林固定的石蠟包埋（FFPE）樣品的RNA質(zhì)量的十分有效的評價標準。 為了解決這個問題，Illumina 的科學家開發(fā)了 DV200 這個檢測標準，它可以計算 RNA 片段大于 200nt 大小的百分比。 考慮到 DV200 值和二代文庫產(chǎn)量之間的更強的相關性，與 RQN 值相比，DV200 的評價對于評估 FFPE RNA 質(zhì)量是更為理想的。 不同 DV200 評分的 FFPE RNA 樣品 基因組 DNA 和 FFPE DNA 使用 DNA 卡夾檢測所測樣品后，Qsep 軟件可以自動準確地測定 gDNA 樣本的大小和 DQN。 DNA 在福爾馬林固定過程中經(jīng)歷了大量的化學修飾，包括與蛋白質(zhì)交聯(lián)和降解成較小的片段。 從 FFPE 樣品中分離出的 DNA 質(zhì)量因固定方法和標本組織年齡的不同而有很大差異。使軟件中 Smear 功能可以對降解的 FFPE DNA 進行質(zhì)量評估（如下圖，以 1k 為閾值）。 它們提供 DQN 值進行簡化的質(zhì)量評估，用于指導以下內(nèi)容： 1. 第一次擴增中使用的 PCR 循環(huán)次數(shù) 2. 打斷所用的條件 3. 文庫構建的質(zhì)量 FFPE樣本檢測DQN情況對比 其后對這四個樣品進行分批次建庫，多批次結果均一致，對文庫用 Qsep 進行片段檢測，結果如下圖。 對應樣本的文庫質(zhì)控結果 如圖所示，質(zhì)量評分最低的最后一個樣本，所構建文庫大小顯著偏小，引物二聚體殘留較多，此外文庫濃度也是4個文庫中最低，且多批次一致。因此文庫質(zhì)量的好壞除建庫方法和過程細節(jié)外，最重要的還是初始的樣本質(zhì)量。文庫質(zhì)量的高低也影響了后續(xù)測序的結果以及數(shù)據(jù)的結果，因此做好提取樣品的質(zhì)控是第一步，也是最關鍵的一步。 建庫前樣品 在文庫構建前對樣品進行片段打斷時可以對打斷的樣品進行一次質(zhì)控，用于檢測打斷的條帶是否滿足預期需求，以確定是否需要改變打斷的條件。 打斷樣品的檢測圖 可通過軟件 Smear 功能來確定片段的主要分布區(qū)間，以期得到最佳打斷打斷效果。 腫瘤液態(tài)活檢中游離核酸提取質(zhì)量的質(zhì)控也是目前相對比較熱門的方向，不少用戶使用 Qsep 系列來檢測 cfDNA 樣品，Qsep 系列可以達到 pg 級的檢測靈敏度，對于 cfDNA 樣品的檢測相對輕松，可以準確測定樣品的目的區(qū)域和大片段核酸的分布比例 cfDNA 樣品的檢測圖 單細胞測序中 RNA 反轉錄后的產(chǎn)物 cDNA 樣品的檢測，通過檢測 cDNA 的片段分布來定是否能進行文庫構建。 cDNA 樣品的檢測圖 文庫 不同的二代測序文庫根據(jù)測序儀的讀長需求會有不同的大小分布，軟件可以根據(jù)調(diào)點的分布準確的測定條帶的分布區(qū)間，使用 Smear 分布功能，可以準確計算文庫的平均片段以及主要片段集中區(qū)域。 文庫的片段分布檢測圖 以上案例結果均來自 Qsep 系列全自動毛細管電泳評估分離的核酸樣品的質(zhì)量， Qsep 系列全自動毛細管電泳儀 Qsep 系列全自動毛細管電泳儀可在高通量測序中進行全程的樣品質(zhì)控，為穩(wěn)定高質(zhì)量的數(shù)據(jù)產(chǎn)出提供保證，讓文庫的構建的每一步都可以清晰的進行回溯。 不同通量的 Qsep 系列全自動毛細管電泳儀 采用可拋棄式的預制膠卡夾，即插即用，全自動進樣，無須人工制膠、灌膠、上樣，免去了手工制膠的繁瑣，能讓一般用戶在短時間內(nèi)學會操作系統(tǒng)，并自動分析樣品得出結果?？捎糜?DNA、RNA 和蛋白檢測 ，通量靈活，可處理 1-100 個任意個數(shù)樣本。且具有單通道和四通道型號儀器，可滿足不同用戶需求，單次使用樣本量極少，且最低檢測限為 pg 級。