肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡率排名第四的癌種，而其中75%-85%為肝細胞肝癌（HCC）。目前HCC最有效的治療手段是手術(shù)切除，但是其具有極高的復(fù)發(fā)率（術(shù)后5年復(fù)發(fā)率為50%-70%），其中術(shù)后2年內(nèi)的早期復(fù)發(fā)更是占復(fù)發(fā)性HCC的70%，并且?guī)缀踝屷t(yī)生束手無策，生存率極低【1】。HCC的臨床結(jié)果讓人沮喪，而這背后的分子機制卻一直不為人所知。

近年來，隨著免疫檢查點阻斷（ICB）療法在某些類型癌癥的臨床治療中初見成效，人們期望以此改善HCC的治療，卻也是事與愿違，HCC對免疫治療的反應(yīng)并不令人滿意。這其中一個很大的原因在于腫瘤復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，而全面細致地了解這個由多種異質(zhì)性細胞（包括惡性細胞、免疫細胞和基質(zhì)細胞）通過時空相互作用而形成的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，必將對腫瘤的發(fā)展、預(yù)后和治療產(chǎn)生重大的影響。毫無疑問，腫瘤的免疫微環(huán)境對ICB治療效率有著重要的影響【2】。復(fù)發(fā)性腫瘤常根據(jù)原發(fā)腫瘤的分子和病理特征進行治療，但事實上它們是否具有相似的微環(huán)境特征尚未得到評價。因此，深入剖析HCC的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)無疑將有助于了解HCC的免疫逃逸機制，并很可能為HCC尤其是復(fù)發(fā)患者提供更有效的免疫治療策略。已有一些研究從單細胞層面描述了原位HCC的免疫細胞和腫瘤細胞異質(zhì)性圖譜【3,4】，但是在單細胞分辨率水平上對早期復(fù)發(fā)HCC的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)和免疫表型的描述仍是空白。

2020年12月23日，來自復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院的樊嘉院士團隊在Cell上在線發(fā)表題為“Single-cell landscape of the ecosystem in early-relapse hepatocellular carcinoma”的文章，對來自18個原發(fā)性或早期復(fù)發(fā)性HCC患者的16,498個細胞進行全長單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，首次深度全面地剖析了早期復(fù)發(fā)性HCC的腫瘤免疫微環(huán)境。發(fā)現(xiàn)在早期復(fù)發(fā)性腫瘤中的惡性細胞具有更高的免疫逃逸特性，從而可能抑制樹突細胞激活CD8+T細胞的能力。揭示了與HCC復(fù)發(fā)相關(guān)的免疫應(yīng)答改變的獨特方面，為HCC合理的免疫治療提供了重要指導(dǎo)。

為了了解早期復(fù)發(fā)HCC的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，本文的研究人員收集了12例未經(jīng)治療的原發(fā)性HCC患者和6例早期復(fù)發(fā)性HCC患者的外科手術(shù)腫瘤樣本和配對的癌旁組織，用細胞分選（FACS）分離CD45+和CD45-細胞，然后對通過質(zhì)控的16,498個細胞進行單細胞測序（scRNA-seq），作為發(fā)現(xiàn)隊列（discovery cohort）。此外，研究人員招募另外4名患者（包括配對的原發(fā)性樣本PT和早期復(fù)發(fā)性樣本RT）為驗證隊列1（validation cohort 1），同時來自另外的47名患者的配對的PT和早期RT樣本用于免疫組化（IHC）和批量RNA測序驗證，為驗證隊列2（圖1）。

根據(jù)測序結(jié)果，研究人員鑒定并區(qū)分出24類細胞集群，并且發(fā)現(xiàn)RT和PT具有相同的主要免疫細胞亞型（包括骨髓源性細胞、T細胞、B細胞、漿細胞和自然殺傷細胞）和相似的淋巴源性和骨髓源性細胞比例。但是，進一步對骨髓源性細胞和T細胞/NK細胞進行無監(jiān)督聚類分析發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性HCC腫瘤微環(huán)境相比，復(fù)發(fā)性HCC具有其獨特的免疫生態(tài)系統(tǒng)，表現(xiàn)為樹突細胞（DC）比例增加，Treg細胞減少，T細胞增殖減少，CD8+ T細胞豐度更高。這些發(fā)現(xiàn)也被驗證隊列1的scRNA-seq以及驗證隊列2的IHC結(jié)果所進一步證實了。

隨后，研究人員利用Monocle（構(gòu)建細胞的狀態(tài)轉(zhuǎn)換軌跡的軟件）推斷HCC浸潤的CD8+ T細胞的動態(tài)免疫狀態(tài)和細胞轉(zhuǎn)換軌跡，而根據(jù)與轉(zhuǎn)換狀態(tài)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化可以將CD8+ T細胞群分為4期。1期細胞的主要特點是CCR6、CCR7、NCR3和KLRB1的表達上調(diào)，而GZMA、GZMB和GZMH的表達降低，提示細胞毒性能力最低；2期細胞的JUN、FOS、NR4A1、NR4A3的表達水平最高，與肝駐留記憶細胞表型相匹配；3期的特征是典型的細胞毒性基因表達水平升高，T細胞衰竭標(biāo)記物表達水平降低；4期的特征是與T細胞衰竭相關(guān)基因的水平升高。結(jié)果顯示在PT和RT樣本中CD8+ T細胞表現(xiàn)出相同的轉(zhuǎn)換軌跡，但卻表現(xiàn)出明顯不同的免疫和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。RT樣本中的CD8+ T細胞主要表現(xiàn)為1期和2期特征，只有少數(shù)表現(xiàn)為耗盡的4期，表明存在一種常駐記憶表型；相反，PT中的CD8+ T細胞主要為3期和4期細胞特征，表明從細胞毒性向衰竭狀態(tài)的過渡過程（圖2）。由此提示治療原發(fā)性和復(fù)發(fā)性HCC應(yīng)考慮不同的免疫治療策略。

對RT樣本中CD8+ T細胞的獨特轉(zhuǎn)錄狀態(tài)進行進一步的分析發(fā)現(xiàn)，與PT樣本中的衰竭狀態(tài)截然不同，RT樣本的CD8+ T細胞中KLRB1過表達，表現(xiàn)為先天性功能失調(diào)狀態(tài)，并且細胞毒性和免疫抑制較低。同時值得注意的是，KLRB1高表達CD8 T細胞相關(guān)基因表達信號的富集與復(fù)發(fā)性和原發(fā)性HCC的預(yù)后和腫瘤進展密切相關(guān)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，RT樣本中CD8+ T細胞幾乎沒有表現(xiàn)出克隆性擴增，而RT樣本中CD8+ T細胞的非活化表型可能是由于在復(fù)發(fā)腫瘤細胞中丟失了匹配的新抗原。由此提示由于腫瘤的選擇（部分原因）CD8+ T細胞克隆在RT中處于低增殖和無反應(yīng)狀態(tài)，這些細胞不能識別和消除帶有亞克隆新抗原的復(fù)發(fā)腫瘤細胞。

那么PT和RT之間腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的如此巨大的差異是由什么造成的呢？答案是兩者惡性細胞之間的差異。研究人員發(fā)現(xiàn)RT中的惡性細胞表現(xiàn)出免疫逃逸能力的增強和細胞增殖能力的減少。復(fù)發(fā)的惡性細胞可以通過PD-L1-CD80和CTLA4-CD80軸破壞DC細胞的抗原呈遞，并通過CCL20-CCR6軸招募先天性CD161+CD8+T細胞，從而在早期復(fù)發(fā)的HCC中形成功能失調(diào)的抗腫瘤免疫。

綜述所述，本文提供了一個全面的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜來描述原發(fā)性和早期復(fù)發(fā)性HCC的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，揭示了早期復(fù)發(fā)性HCC的獨特的免疫生態(tài)系統(tǒng)，其特征為典型免疫抑制細胞Treg的比例降低，DC和先天性CD161+CD8+T細胞的比例增加，具有功能失調(diào)的細胞毒性和低增殖能力（圖3），為理解免疫環(huán)境如何影響腫瘤復(fù)發(fā)邁出了重要的一步。同時揭示了HCC復(fù)發(fā)惡性細胞與免疫細胞之間存在著積極的相互影響，從而促進了腫瘤細胞逃避抗腫瘤免疫。由此將有助于開發(fā)更有效的治療靶點和HCC患者的免疫治療的生物標(biāo)志物。