該方法采用高效液相色譜法測定維生素D3的含量。
一、方法原理：供試品和內(nèi)標(biāo)均制成甲醇溶液，進(jìn)入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分離，用紫外吸收檢測器，于波長254nm處檢測維生素D3（C27H44O）和內(nèi)標(biāo)鄰苯二甲酸二甲酯的吸收值，計(jì)算出其含量。
二、試劑：
1.異辛烷
2. 正己烷
3. 正戊醇
三、儀器設(shè)備：
1. 儀器
1.1 高效液相色譜儀
1.2 色譜柱
硅膠為填充劑，維生素D2峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。
1.3 紫外吸收檢測器
2. 色譜條件
2.1 流動(dòng)相：正己烷+正戊醇=997:3
2.2 檢測波長：254nm
2.3 柱溫：室溫
三、試樣制備：
1. 稱取供試品
精密稱取該品25mg，置100mL棕色量瓶中。
2. 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取維生素D3對(duì)照品和維生素D3對(duì)照品25mg，置100mL棕色量瓶中，加異辛烷80mL，避免加熱，超聲處理1分鐘使完全溶解，并加異辛烷至刻度，搖勻，沖氮密塞，避光，0℃以下保存。
3. 內(nèi)標(biāo)溶液的制備
取鄰苯二甲酸二甲酯25mg，置25mL量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，即得。
4. 供試品溶液的制備
上述供試品加三甲基戊烷80mL，避免加熱，用超聲處理1分鐘使溶解，加三甲基戊烷稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
注：“精密稱取”系指稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所取重量的千分之一?！熬芰咳　毕抵噶咳◇w積的準(zhǔn)確度應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)該體積移液管的精度要求。
四、操作步驟：
分別精密吸取上述供試品溶液與對(duì)照品溶液，20μL 注入高效液相色譜儀，用紫外吸收檢測器，于波長254nm處測定維生素D3和內(nèi)標(biāo)鄰苯二甲酸二甲酯的吸收值，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。