五氯苯酚（又名五氯酚）及其鈉鹽五氯酚鈉（又名五氯酚酸鈉）是持久性環(huán)境污染物，常用作殺蟲劑，皮革、木材防腐劑，農(nóng)業(yè)除草劑以及吸血蟲中間宿主釘螺的滅殺等。五氯苯酚及其鈉鹽化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難降解，可在環(huán)境中擴(kuò)散傳播和在食物鏈中蓄積，通過環(huán)境或食物鏈進(jìn)入動植物和人體內(nèi)，當(dāng)人體內(nèi)五氯苯酚及其鈉鹽蓄積到一定量后可能會導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂、致癌、致畸和誘發(fā)人體器官病變等。我國國家食品安全監(jiān)督抽檢實施細(xì)則（2019年版）將水產(chǎn)品、畜禽肉及其副產(chǎn)品中五氯苯酚及其鈉鹽作為必檢項目，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號規(guī)定食品動物中不得檢出五氯苯酚及其鈉鹽。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定五氯苯酚及其鈉鹽無需衍生化，方法簡單、靈敏度高，但容易受到基質(zhì)抑制作用影響，因此需對樣品進(jìn)行凈化，QuEChERS法具有簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、高效等優(yōu)點，適用于大批量樣品快速檢測，廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留和獸藥殘留檢測。

因此，廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院建立QuEChERS萃取，Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱凈化，基質(zhì)匹配-同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法結(jié)合LC-MS/MS法測定奶粉中五氯苯酚的分析方法，縮短樣品前處理時間、簡化樣品前處理過程、降低基質(zhì)效應(yīng)、提高大批量樣品的檢測效率，彌補(bǔ)奶粉基質(zhì)中五氯苯酚檢測方法缺失，以期為開展相關(guān)風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 質(zhì)譜方法優(yōu)化

五氯苯酚分子中氯原子存在35Cl和37Cl同位素，在ESI-下，五氯苯酚和五氯苯酚-13C6分別監(jiān)測到m/z相差為2的多個母離子（Q1）峰。五氯苯酚母離子質(zhì)量數(shù)分別為262.8、264.8、266.8、268.8、270.8；五氯苯酚-13C6母離子質(zhì)量數(shù)分別為268.8、270.8、272.8、274.8、276.8。對上述各個母離子進(jìn)行碎裂，均未監(jiān)測到任何子離子（Q3）碎片，分析其原因可能是五氯苯酚和五氯苯酚-13C6分子結(jié)構(gòu)對稱，共軛性強(qiáng)，結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，難以碎裂產(chǎn)生特征子離子碎片。

本實驗選擇離子對m/z 262.8/262.8、264.8/264.8、266.8/266.8、268.8/268.8作為五氯苯酚監(jiān)測離子，與田春霞等的研究和GB 23200.92—2016一致。通過優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量后m/z 264.8/264.8響應(yīng)最高，但實際樣品檢測中發(fā)現(xiàn)該離子MRM圖顯示雜峰較多，m/z 262.8/262.8雜峰最少。因此，選擇m/z 262.8/262.8作為定量離子對，其余離子作為定性離子，符合歐盟EC657/2002對串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜進(jìn)行化合物定性鑒別要求。由于五氯苯酚和內(nèi)標(biāo)五氯苯酚-13C6存在相同質(zhì)量數(shù)的母離子m/z 268.8、270.8，為避免干擾定量，五氯苯酚-13C6選擇m/z 272.8/272.8離子對的峰面積參與計算，其余離子作為定性離子。

2 前處理方法選擇與優(yōu)化

2.1 提取條件優(yōu)化

本實驗先以5 倍于奶粉質(zhì)量的水體積充分溶解奶粉，破壞奶粉顆粒，釋放奶粉中可能存在的待測化合物，然后通過酸水解法或堿水解法使可能以結(jié)合態(tài)形式存在的待測化合物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，再進(jìn)一步用有機(jī)試劑提取，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。甲醇或乙腈均可作為提取試劑和蛋白沉淀劑，但乙腈的萃取回收率和蛋白沉淀效果優(yōu)于甲醇，因此，本實驗選擇乙腈作為提取試劑和蛋白沉淀劑。

為避免同位素稀釋法經(jīng)內(nèi)標(biāo)折算后不能體現(xiàn)方法的回收率差異，除特殊說明外，本實驗涉及的回收率比較均采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，以此確定最佳的實驗條件，最終形成最優(yōu)的同位素稀釋樣品前處理方法。

采用空白奶粉樣品添加五氯苯酚5 μg/kg，比較酸水解法和堿水解法的回收率差異。酸水解法是用甲酸替代氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液，其余步驟按原文1.3.3節(jié)操作；堿水解法完全按1.3.3節(jié)操作。結(jié)果表明，堿水解法比酸水解法回收率高約25%～35%，且重復(fù)性更好。其原因可能是部分五氯苯酚與奶粉中含有羧基（—COOH）或氨基（—NH2）的物質(zhì)相互作用，形成了結(jié)合態(tài)，堿水解法可以將結(jié)合態(tài)、分子態(tài)等形式存在的待測化合物充分轉(zhuǎn)化為易溶于水的五氯苯酚鈉，有利于充分提取，回收率更高，重復(fù)性更好；酸水解法對結(jié)合態(tài)存在的待測化合物作用不明顯，回收率偏低。因此，本實驗選擇堿水解法。

2.2 QuEChERS方法優(yōu)化

QuEChERS法萃取與固相萃取法相比，更簡單、更高效、成本更低、重復(fù)性更好，同時具備萃取和初步凈化樣品作用，避免了固相萃取法步驟繁瑣、耗時長、堵塞柱子以及重復(fù)性不穩(wěn)定等缺點，本實驗優(yōu)先選擇QuEChERS法萃取，適用于大批量樣品快速檢測。

QuEChERS萃取常用的鹽析試劑有無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。在優(yōu)化的實驗條件下，比較無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉對五氯苯酚萃取回收率的影響，以基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量計算回收率，結(jié)果表明，無水硫酸鎂作鹽析試劑時，回收率最高。進(jìn)一步比較無水硫酸鎂添加量為1、2、3、4 g對回收率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)溶解奶粉的水與無水硫酸鎂添加量比例為5∶1（mL/g）時，回收率最佳；當(dāng)無水硫酸鎂添加量超過該比例時，回收率有所下降，這可能是由于過量無水硫酸鎂加入瞬間局部水分被迅速吸收，形成的顆粒物吸附五氯苯酚。

多次萃取可提高目標(biāo)化合物的回收率，但前處理耗時長，需要消耗更多有機(jī)試劑。本實驗使用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法檢測，僅需QuEChERS法萃取一次，回收率達(dá)到90%以上，操作簡單、顯著縮短樣品前處理時間，有利于大批量樣品快速檢測。

2.3 樣品凈化

奶粉樣品含有大量蛋白質(zhì)、約16%脂肪以及約1%～3%磷脂。QuEChERS法同時起到萃取和去除無機(jī)鹽、水溶性雜質(zhì)等凈化作用，但脂肪和磷脂也會被乙腈提取出來，這些雜質(zhì)對五氯苯酚檢測起基質(zhì)抑制作用，需進(jìn)一步凈化。Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱可同時去除乙腈提取液中脂肪和磷脂，有效降低基質(zhì)抑制，與GB 23200.92—2016的MAX固相萃取柱凈化相比，整個凈化過程省略了活化、淋洗、洗脫等步驟，簡化凈化流程，直接收集流出液即完成凈化操作，顯著提高前處理效率，且樣品加標(biāo)絕對回收率比GB 23200.92—2016高約10%～15%，因此，選擇采用Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱對樣品提取液作進(jìn)一步凈化。

用空白基質(zhì)提取液配制相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用尼龍66（材質(zhì)為聚己二酰己二胺）和聚四氟乙烯材質(zhì)的有機(jī)系針式濾頭過濾，比較不同材質(zhì)濾頭對五氯苯酚的吸附作用。結(jié)果表明，尼龍66有機(jī)系針式濾頭對五氯苯酚有吸附，五氯苯酚損失約30%～35%；聚四氟乙烯有機(jī)系針式濾頭對五氯苯酚無吸附。其原因可能是尼龍66濾膜材質(zhì)的胺基（—NH—）與五氯苯酚的酚羥基結(jié)合，使部分五氯苯酚保留在濾膜上，導(dǎo)致五氯苯酚損失，但將過濾后的濾液用同一個濾頭再過濾一次，損失率下降至10%左右，可能是由于再次過濾能將保留在濾膜上的五氯苯酚洗脫下來；聚四氟乙烯不存在與五氯苯酚發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)，所以五氯苯酚無損失。因此，選擇使用PTFE材質(zhì)的有機(jī)系針式濾頭過濾。

3 方法學(xué)考察

3.1 基質(zhì)效應(yīng)

除不加同位素內(nèi)標(biāo)外，按照優(yōu)化的前處理方法對添加五氯苯酚3 μg/kg的奶粉樣品進(jìn)行6 個平行測定，制得樣品待測液，考察基質(zhì)效應(yīng)。分別用乙腈、甲醇、空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別對樣品待測液進(jìn)行外標(biāo)法定量，計算平均回收率。結(jié)果表明，以乙腈、甲醇配制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量的平均回收率分別為33%、25%；以空白基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量（基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量）的回收率為63%；表明存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制作用。為降低或消除基質(zhì)抑制作用，本實驗采用空白基質(zhì)提取液與同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法相結(jié)合配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量，平均回收率為90%，有效降低基質(zhì)抑制作用，使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。由于五氯苯酚未能碎裂形成子離子碎片，實際樣品的提取離子色譜圖顯示雜峰較多，采用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法可提高定性鑒別準(zhǔn)確度。

3.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

五氯苯酚的空白基質(zhì)提取液-同位素稀釋內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在質(zhì)量濃度0.2～150 μg/L范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，線性方程為y＝0.24256x+0.04470，相關(guān)系數(shù)r＝0.9960。以不含五氯苯酚的奶粉樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品的方式考察方法檢出限和定量限，分別以定量離子3 倍信噪比和10 倍信噪比響應(yīng)值對應(yīng)的含量作為方法檢出限和定量限，方法檢出限和定量限分別為0.5、1.5 μg/kg。在1.3.5節(jié)和1.3.6節(jié)條件下測定，獲得的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品（10 μg/L）的提取離子色譜圖。

3.3 回收率和精密度

在2 g（精確至0.01 g）不含五氯苯酚的奶粉樣品中分別添加質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液30、60 μL，1 μg/mL五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液30 μL（添加水平分別相當(dāng)于樣品中五氯苯酚含量為1.5、3.0、15.0 μg/kg），然后在每個樣品中添加100 μL質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的五氯苯酚-13C6標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平平行測定6 次，空白基質(zhì)提取液-同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量，考察方法回收率和精密度，結(jié)果見表3，平均回收率為90.3%～119.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為5.8%～7.5%，回收率和精密度均符合GB/T 27404—2008附錄F之F.1回收率和F.3精密度要求，滿足奶粉中五氯苯酚殘留量檢測要求。1.3.5節(jié)和1.3.6節(jié)條件下測定，獲得的空白奶粉樣品添加15.0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子色譜圖。

4 實際樣品測定

采用建立的方法對45 批奶粉樣品（嬰幼兒配方奶粉1 段15 批次，2段10 批次，3段10 批次，中老年奶粉10 批次）進(jìn)行檢測，均未檢出五氯苯酚。

5 結(jié)論

本實驗建立QuEChERS萃取，Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱凈化，基質(zhì)匹配-同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法結(jié)合LC-MS/MS測定奶粉中五氯苯酚的分析方法。在水浴加熱條件下，采用堿水解法將奶粉中可能以結(jié)合態(tài)、分子態(tài)形式存在的待測化合物充分轉(zhuǎn)化為易溶于水的五氯苯酚鈉，在乙腈存在條件下，用甲酸將五氯苯酚鈉轉(zhuǎn)化為不溶于水、易溶于乙腈的五氯苯酚，再以無水硫酸鎂為鹽析試劑的QuEChERS法萃取，用Captiva EMR-Lipid脂質(zhì)去除凈化柱對樣品提取液作進(jìn)一步凈化，凈化液與水按1∶1比例混合后，用LC-MS/MS測定，以基質(zhì)匹配-同位數(shù)稀釋內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法定量，本方法具有操作簡單、快速、回收率高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，彌補(bǔ)了奶粉中五氯苯酚殘留量檢測方法缺失，為開展相關(guān)風(fēng)險監(jiān)測提供技術(shù)支持。

相關(guān)鏈接：五氯苯酚，甲酸，無水硫酸鎂，氫氧化鈉溶液，聚四氟乙烯，乙腈，北納生物

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