RT-PCR也分兩種類型：一步法(One-step PCR)和兩步法(Two-steps PCR)。 前者，RT反應(yīng)和PCR擴增是在同一個反應(yīng)管中進行的；而后者，RT反應(yīng)與PCR擴增反應(yīng)單獨進行。 盡管這兩種方法都能得到最終的結(jié)果，但是每種方法都有優(yōu)缺點。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點。 一步RT-PCR消除了樣品轉(zhuǎn)移步驟，不僅消除了控制物污染的潛在來源，而且需要較少的準備和操作時間。又因一步RT-PCR中所使用的引物是基因特異性的，靈敏度高，常用于分析低表達水平基因。而其不足在于同一樣本中只有有限數(shù)量的目的基因被擴增，且需要在轉(zhuǎn)錄和擴增間尋找一個平衡。 所以當時間對實驗很重要時，一般采用一步法，如檢測RNA病毒，也適用于高通量分析。 由于該法的檢測結(jié)果準確率高，因而在需要測量表達水平上的細微差異時，也可采用此方法。 而兩步RT-PCR可將大批量的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后儲存cDNA用于后續(xù)實驗，可檢測大量基因；在分別優(yōu)化RT和PCR步驟后，可更好地控制實驗過程；又因只有少量的轉(zhuǎn)錄本被用 于PCR，則任何可能從RNA分離到RT反應(yīng)的抑制劑（如乙醇、酚及胍鹽等）都被稀釋了。 但是兩步RT-PCR更耗費時間,且?guī)砦廴镜目赡苄愿?RT過程應(yīng)以相同效率反轉(zhuǎn)錄RNA， 否則會影響qPCR的啟動效率，進而帶來不同的實驗結(jié)果，因此對于每個RT反應(yīng)應(yīng)使用相同的條件。 如果你需要對同一樣本的多個目標進行分析時，可選擇兩步RT-PCR。另外，當RNA的存儲是個問題時，最好是進行兩步RT-PCR，因為cDNA在-20°C是穩(wěn)定的。