作為一名生物汪，我們在研究基因的功能時，逃脫不掉的就是我們?yōu)榱宋覀兊膶嶒災康?，可能需要?gòu)建各種載體，比如表達載體，克隆載體，基因打靶載體等等。很多人在構(gòu)建載體的 時候都感覺很困難，特別是對于一個剛進入實驗室的新人來說那更是難上加難，完全摸不著 頭腦。 那是因為其實構(gòu)建載體是一個不小的工作量，需要經(jīng)歷很多的過程，比如首先我們需要設(shè)計引物引入酶切位點，接下來還需要經(jīng)歷酶切酶連等過程，只要其中的某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，那 最終都會導致實驗失敗。 我認為構(gòu)建載體最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計引物引入酶切位點，一旦引物設(shè)計好，那接下來就非常簡單了。 1.打開snapgene軟件，選擇第一個（紅線標記），然后輸入基因的CCDS序列（基因的CCDS序列可 在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得）。 2.點擊ok后界面如下，圖中顯示的是會切割基因編碼序列的酶. 3.接下來點擊最上面的Enzymes Noncutters,會顯示所有不會切割基因編碼序列的酶，這些酶都是我們可以用的，選酶的標準：要選擇不能切割目的基因序列并且質(zhì)粒上含有的酶，還有就是最好是實驗室有的酶。 4.確定了可以用的酶后，接下來需要確定設(shè)計引物時用的這兩種酶，確定方法：這兩種酶 最好不要鄰近，最好使用雙酶切有共同buffer的酶，兩個酶切位點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切。 5.確定了所要用的酶之后，接下來需要做的就是設(shè)計引物并引入酶切位點（注意：一定要看清楚載體上promoter的方向，將CDS正向插入到promoter后面） 6.點擊左下角的sequence，然后拉取上游一部分基因本身的序列，拉取的時候會顯示拉取的堿基的個數(shù)以及Tm值，拉取到Tm值55度左右就可以（55度以上最好）. 7.然后點擊 primer add primer， 選擇 top strand. 8.點擊insertions,在site位置處選擇你準備引入的酶，比如我要引入EcoR I,那我就選擇它，然后點擊insert，這樣我們就引入了該酶的酶切位點。 9.接下來需要添加保護堿基，我一般所有的酶的保護堿基都加三個，加哪個堿基沒有要求,使GC含量及Tm值適中即可。 10.這樣上游引物就設(shè)計好了，接下來需要檢測一下引物是否會形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，可以應用OligoCalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html )，如果發(fā)現(xiàn)會形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，那就需要對引物序列做出一些調(diào)整，直到發(fā)卡結(jié)構(gòu)消失。 11.接下來拉取基因的下游的一部分序列，用同樣的方法設(shè)計好下游引物，有一點需要注 意的是，設(shè)計下游引物的時候選擇bottom strand。這樣構(gòu)建載體所需的引物就設(shè)計好了，怎么樣，是不是感覺其實也沒有那么難，接下來就可以構(gòu)建屬于你自己的載體了。